技术服务描述

CRISPR-Cas9基因敲入系统（knock in）

☞实验原理：

CRISPR-Cas9基因敲入系统是Cas9内切酶切割双链DNA，且有一段高度同源的DNA修复模板存在的情况下，生物体内启动HDR修复路径，将一段外源DNA定点插入基因内部。

同源性定向修复（HDR）途径，对比NHEJ修复途径，同源性定向修复（HDR）途径是更为精确的修复机制。 这种修复机制主要用于CRISPR Cas9系统介导的基因敲入。 在该修复路径中，需要将一段与预期编辑位点上下游紧邻序列具有高度同源性的DNA修复模板、特异的gRNA和Cas9核酸酶一起引入细胞中。 在高度同源性DNA模板存在的情况下， HDR机制可以通过同源重组将一段DNA插入编辑位点（图4）。这种修复方式可以将一段DNA序列精准地插入特定的基因组位点。

图1基因敲入原理图

☞实验流程

1. 设计sgRNA-Cas9及修复DNA模版

2 .构建sgRNA-Cas9质粒及修复DNA模板质粒

3 .将sgRNA-Cas9、修复DNA模版共转293T细胞

4 .嘌呤筛选，检测荧光

5 .PCR检测基因组，RFP蛋白是否敲入

☞实验步骤

1、设计sgRNA及修复DNA模版

针对人类AAVS1 AAVS1 Safe Harbor基因设计了sgRNA进行软件分析以确保sgRNA没有预测的脱靶结合位点。设计DNA修复模版，两侧同源臂，其两侧各有600bp的同源臂。

2、 构建sgRNA质粒及修复DNA模板质粒

将选定的sgRNA设计与CMV启动子驱动的Cas9基因一起克隆到pCas-Guide中以制备pCas-Guide-AAVS1（图2）。

将DNA修复模板插入含有RFP-嘌呤霉素的pAAVS1-RFP-DNR表达载体（图2）。

 图2 sgRNA-Cas9质粒及修复DNA模版质粒

3 、将sgRNA-Cas9、修复DNA模版共转293T细胞

用lipofectmine2000转染试剂将上述两种质粒转染至293T细胞。

4、 嘌呤筛选，检测荧光

嘌呤筛选3-4周

3-4周后，> 95％的HEK293细胞表达RFP（图3）。

图3 荧光检测图片  A转染筛选后明场图片   B转染筛选后荧光图片 C未转染加嘌呤筛选细胞

5 、PCR检测基因组，RFP蛋白是否敲入

为了证实在基因组DNA中敲入RFP，设计引物对，引物1靶向RFP上游的5'同源臂和靶向RFP-嘌呤霉素基因内的引物2。1.1kb的PCR产物表明在AAVS1位点敲入成功; 没有PCR扩增指示敲入不成功（图4）。

图4  PCR产物检测，在对照细胞（'WT细胞'）中没有看到PCR扩增