技术服务描述

此文为Chip-seq报告的解读文件：

• 以下红字灰色背景为每一小节的结果解读信息

• 结果解读位于每一小节末尾

1. 工作流程

染色体免疫共沉淀（ChIP）是一种用于研究蛋白质与 DNA 的体内相互作用的经典实验技术。采用特异性抗体将目的蛋白进行免疫沉淀，由此可以把目的蛋白所结合的基因组 DNA 片段也富集下来。通过与高通量测序技术的结合，对 ChIP 后的DNA 产物进行测序分析， 从全基因组范围内寻找目的蛋白的 DNA 结合位点，以高效率的测序手段得到高通量的数据结果。

1.1. ChIP 免疫沉淀实验流程

目前主要有两种不同的ChIP 实验方法，大致流程如下（以细胞样品的处理过程为例）：

Cross-liking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP)

1. 准备足量的新鲜细胞，每个IP约4x10⁶个细胞，用新鲜的1%的甲醛处理细胞，进行细胞交联。

2. 125mM的甘氨酸终止交联，收集细胞。

3. 超声或酶解打断染色质，将基因组 DNA 打断至 100-500bp。

4. 将抗体（一般为1～5ug）与染色质片段4℃孵育过夜。

5. 加入proteinA/G beads进行4℃孵育4-6小时。

6. Proteinase K 解交连。

7. 酚氯仿或DNA提取试剂盒提取DNA

8. QPCR 检测或建库测序

1.2. ChIP Sequencing 文库构建流程

1. 用qubit 对ChIP片段进行定量检测

2. 补齐片段末端，并在3’末端加A尾

3. 添加Adapter

4. 0.8X AMPure beads去掉多余的Adapter

5. 文库PCR扩增

6. 1XAMPure beads 去掉多余的primer

7. qPCR测定文库浓度

8. Agilent 2100测定文库片段大小

1.3. 生物信息分析流程

将测序结果与参考基因组比对，比对上唯一位置的序列用于后续标准信息分析及个性化分析。信息分析流程如下：

此节内容为Chip-seq基本流程介绍，包括

• 实验流程

• 建库流程

• 分析流程

2. 数据结果及生物信息分析

2.1. ChIP Sequencing 文库质检结果

文库片段质检，ChIP文库的染色质片段在100-500bp之间，建库加入约140bp的接头后，片段应该分布在250-700bp之间为最好。

Fragment Analyzer （FA）毛细管电泳检测：

检测结果汇总：（以下结果中文库大小为 FA 判定结果）

此节内容为Chip-seq文库构建质检结果展示：

• 图中展示了各个样本文库大小及浓度等信息

2.2. 测序数据质量控制

对原始测序数据及去除接头后的可用数据进行质量评估。

具体的qc报告见：

Results/2.2.QC/qc_Demo-H3K27ac.html
Results/2.2.QC/qc_supplement.html

本节展示了ChIP-seq数据的质量：

• 比对情况

• 测序深度

• 组内重复性

• peaks数量、长度分布

• peaks中reads的数量百分比

• ...

2.3. Reads 在全基因组的可视化分布

使用 IGV 软件对 Reads 进行可视化查看，可以查看全基因组任何感兴趣位置的 reads 富集情况，示例如下：

IGV 的安装使用参考： http://software.broadinstitute.org/software/igv/

可视化操作步骤依次是：

在软件的 Genome 选项，基因参考序列 hg38 ；
在软件的 File 选项，上传 要查看染色体 bigwig 文件 以及 narrowPeak文件；
以上文件上传后可查看该染色体任意位置的基因信息及 reads 富集情况。

结果文件 ：

Results/2.3.peak_cover/*

表头说明：

Results/2.3.peak_cover/*.narrowPeak表头说明：

Results/2.3.peak_cover/*.narrowPeak表头说明图示：

此节内容，对结果进行说明并给出了在IGV中可视化的两个最重要的基本文件：

• .bigwig: 测序reads在基因组上的可视化分布结果文件

• .narrowPeak: callPeak结果文件

2.4. 全基因组 Reads 富集峰 Peak 鉴定

采用常用 reads 富集峰鉴定软件 MACS 在全基因范围进行 peak 扫描，得到 Peak 在基因组上的位置信息、peak 富集信息等。

结果文件：

Results/Demo-H3K27ac.PeakAnno.xls
Results/2.4.peak_scan/Demo-H3K27ac.covplot.pdf

表头说明：
Results/*.PeakAnno.xls表头说明：

此节内容包括：

• 所有Peak的临近基因注释结果文件

• callPeak结果在全基因组上的分布情况（高度代表置信度）

2.5. Reads 在 TSS 近端富集强度分析

TSS 转录起始位点近端（0-3kb）与特定的基因转录调控功能有关，统计 reads 在TSS 近端的分布情况。

结果文件：

Results/2.5.tss_near/Demo-H3K27ac.tagheatmap.pdf
Results/2.5.tss_near/Demo-H3K27ac.plotavgprof.pdf

此节内容包括：

• 以TSS为中心向正负拓展3k距离的的Peak富集情况

2.6. Reads 在 TSS 近端及远端富集强度分析

TSS 转录起始位点近端（0-3kb）及远端（10kb以上）的 reads 分布与特定的基因转录调控功能有关，统计 reads 在TSS 近端及远端的分布情况。

结果文件：

Results/2.6.tss_near_far/Demo-H3K27ac.peakAnnodistotss.pdf

此节内容包括：

• 以TSS为中心向正负拓展3k-10k以上距离的的Peak富集情况

2.7. Peak 在基因组上的分布

将 Peak 根据位置信息进行基因组注释基因结构元件，分别统计 Peak 在结构元件（intergenic region、upstream 5K、5`UTR、exon、intron，3’UTR、downstream5k）的数目，并根据其在各个元件上的富集程度，绘制分布特征。

Peak 在基因结构元件上的分布特征：

Peak 在各基因结构元件上的交叉分布特征：

结果文件：

Results/2.7.peak_dis/Demo-H3K27ac.peakAnnobar.pdf
Results/2.7.peak_dis/Demo-H3K27ac.peakAnnopie.pdf
Results/2.7.peak_dis/Demo-H3K27ac.peakAnnoupset.pdf
Results/2.7.peak_dis/Demo-H3K27ac.peakAnnovinnpie.pdf

此节内容包括：

• 所有Peak在基因结构元件上的分布特征（即，各个Peak注释到了基因的什么结构元件的比例统计）

• 所有Peak在各基因结构元件上的交叉分布特征（即，各个Peak注释到的同一个基因，同时分布在多个基因元件的数量统计）

2.8. Peak注释基因的富集分析

  我们将前面分析得到的Peak注释基因，进行后续富集分析。

  我们根据基因表达量分析得到差异基因之后，必须进一步落到基因的功能上来。对于差异分析而言，往往涉及到成千上万个基因，这会使分析变得很复杂。解决思路是将一个基因列表分成多个部分，从而减少分析的复杂度。为了解决怎么分成不同类，通常会对基因功能进行富集分析, 期望发现在生物学过程中起关键作用的生物通路, 从而揭示和理解生物学过程的基本分子机制。功能富集分析可以将成百上千个基因、蛋白或者其他分子分到不同的通路中，以减少分析的复杂度。另外，在两种不同实验条件下，激活的通路显然比简单的基因或蛋白列表更有说服力。基因功能富集分析首先要构建基因集（ gene set，如 GO 和 KEGG 数据库等），也就是基因组注释信息进行分类。然后再把我们的目标基因集（差异基因集或者其他基因集）映射到背景基因集上，注意区分注释与富集。

  我们采用 clusterProfiler 软件对差异基因集进行 GO 功能富集分析， KEGG 通路富集分析等。富集分析基于超几何分布原理，其中差异基因集为差异显著分析所得差异基因并注释到 GO 或 KEGG 数据库的基因集，背景基因集为所有进行差异显著分析的基因并注释到 GO 或 KEGG 数据库的基因集。富集分析结果是对每个差异比较组合的所有差异基因集、上调差异基因集、下调差异基因集进行富集。本报告中展示的表格是选取某一个比较组合的富集分析结果，图片是部分富集分析结果。

2.8.1. 富集分析结果文件

结果文件夹：

• Pathway1 分析结果文件夹：Results/2.8.enrich_pathway1/

• Pathway2 分析结果文件夹：Results/2.9.enrich_pathway2/

• Pathway1 网页预览图：Results/2.8.enrich_pathway1/*-pdf.html

• Pathway2 网页预览图：Results/2.9.enrich_pathway2/*-pdf.html

说明：

• Pathway1中对peaks进行基因注释，仅采用临近基因注释。

• Pathway2中对peaks进行基因注释，需要考虑多个因素，包括注释基因的外显子/内含子，promoter区，也包括peaks两侧可能包含顺式调控元件的区域。

表头说明： （Results/*enrich_*/gene.ego_*.csv GO富集结果列表）

表头说明： （Results/*enrich_*/gene.KEGG*.csv KEGG富集、Results/*enrich_*/gene.ReactomePA*.csv ReactomePA富集 结果列表）

2.8.2. GO功能富集分析

   GO(Gene Ontology) 是描述基因功能的综合性数据库，可分为生物过程（ biological process ）和细胞组成（ cellular component ）分子功能（ Molecular Function ）三个部分。 GO 功能富集以 padj 小于 0.05 作为为显著性富集的阈值，富集结果见结果文件。

  从 GO 富集分析结果中，选取最显著的 20 个 Term 绘制柱状图进行展示，若不足 20 个，则绘制所有 Term ，按生物过程、细胞组分和分子功能三大类别及差异基因上下调分类画的柱状图。

  有向无环图 (Directed Acyclic Graph，DAG) 为差异基因 GO 富集分析结果的图形化展示方式。图中，分支代表包含关系，从上至下所定义的功能范围越来越小，选取每个差异比较组合的 GO 富集结果最显著性前 5 位的 GO Term 作为有向无环图的主节点，并通过包含关系，将相关联的 GO Term 一起展示，颜色的深浅代表富集程度。我们的项目中分别绘制生物过程、分子功能和细胞组分的 DAG 图。

2.8.3. KEGG通路富集分析

   KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 是整合了基因组、化学和系统功能信息的综合性数据库。 KEGG 通路富集以 padj 小于 0.05 作为显著性富集的阈值，富集结果见结果文件。

  从 KEGG 富集结果中，选取最显著的 20 个 KEGG 通路绘制柱状图进行展示，若不足 20 个，则绘制所有通路，如下图所示。图中横坐标为通路富集的显著性水平，数值越高越显著，纵坐标为 KEGG 通路。

  从 KEGG 富集结果中，选取最显著的 20个KEGG 通路绘制散点图进行展示，若不足 20 个，则绘制所有通路，如下图所示。图中横坐标为注释到 KEGG 通路上的差异基因数与差异基因总数的比值，纵坐标为 KEGG 通路，点的大小代表注释到 KEGG 通路上的基因数，颜色从红到紫代表富集的显著性大小。

2.8.4. ReactomePA富集分析

   Reactome数据库汇集了人类等模式物种各项反应及生物学通路。Reactome通路富集以padj小于0.05作为显著性富集的阈值，富集结果见结果文件。

  以下柱状图与散点图与上一节类似，选取最显著的 20个 富集进行展示，若不足 20 个，则绘制所有通路，如下图所示。

此节内容包括：

• 对注释到的基因集的GO富集分析

• 对注释到的基因集的KEGG富集分析

• 对注释到的基因集的ReactomePA富集分析

2.9. Peak 区域 Motif 分析

用 Homer 软件对 Peak 区域鉴定 motif 序列；并将得到的 motif 序列与 JASPAR 数据库（JASPAR CORE 2016 database）进行比对，鉴定已知的 motif。

Homer 结果示例：

结果文件：

Results/2.10.motif/*/*.html

此节内容为所有Peak区域鉴定 motif 结果，包括：

• 基于JASPAR数据库已知查找结果

• 基于denovo预测结果