RNA结合蛋白免疫沉淀技术(RIP)实验流程

. 细胞裂解液获取

A. 单层细胞或者贴壁细胞处理

1. PBS清洗培养皿或培养瓶中的细胞两次

2. 加入冷PBS后用细胞刮将细胞刮下来,收集至enpendoff

3. 1500rpm4离心5min,弃上清,收集细胞

4. 用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞,吹打均匀后于冰上静置5min

5. 每管分装200ul细胞裂解液,贮存于-80

B.  悬浮细胞处理:先收集细胞再计数,然后清洗裂解

C.  组织样品处理

1.PBS清洗新鲜切下的组织三次

2. 加入冷PBS后,用匀浆器或其他细胞分离设备使组织分散为单个细胞,计数

3. 1500rpm4离心5min,弃上清,收集细胞

4. 用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞,吹打均匀后置于冰上静置5min

5. 每管分装200ul细胞裂解液,贮存于-80

磁珠的准备

A. 实验前准备

1enpendoff

2、磁力架

3、冰盒, RIP Wash Buffer置于冰上

4、抗体,置于冰上

5、涡旋震荡器6、枪、枪头放于超净台照射30min,枪喷DEPC

B. 磁珠准备过程

1. 重悬磁珠

2. 标记实验所需的enpendoff管,样品包括目的样品,阴性对照与阳性对照

3. 吸取50ul 重悬后的磁珠悬液于每个enpendoff

4. 每管加入500ul RIP Wash Buffer,涡旋震荡

5. enpendoff管置于磁力架上,并左右转动15°使磁珠吸附成一条直线,去上清,重复一次

6. 100ulRIP Wash Buffer重悬磁珠,加入约5ug相应抗体于每个样品中

7. 室温孵育30min

8. enpendoff管置于磁力架上,弃上清

9. 加入500ul RIP Wash Buffer,涡旋震荡后弃上清,重复一次

10. 加入500ul RIP Wash Buffer,涡旋震荡后置于冰上

.  RNA结合蛋白免疫沉淀

A. 准备工作

1、冰盒

2360°旋转仪

3RIP Wash Buffer 0.5M EDTA RNase Inhibitor 置于冰上

B. RNA结合蛋白免疫沉淀实验过程

1. 准备RIP Immunoprecipitation Buffer

2. 将前上步的enpendoff管放磁力架上,去上清,每管加入900ul RIP Immunoprecipitation Buffer

3. 迅速解冻第一步制备的细胞裂解液,14,000rpm4离心10min。吸取100ul上清液于上一步的磁珠-抗体复合物中,使得总体积为1ml

4. 4孵育3h至过夜

5. 短暂离心,将enpendoff管放在磁力架上,弃上清

6. 加入500ul RIP Wash Buffer,涡旋震荡后将enpendoff管放在磁力架上,弃上清,重复清洗6

四、RNA纯化

A. 实验前准备

1. 枪、枪头、enpendoff管紫外照射30min,喷DEPC水以除RNA

2. Salt SolutionSalt SolutionRIP Wash BufferProteinase K10%SDS Precipitate Enhancer 置于冰上

3.RNase-free的乙醇、氯仿、异戊醇

4.DEPC水置于冰上

5. 离心机预冷

6. 冰盒

B. RNA纯化过程

1.准备Proteinase K Buffer。每个样品需150ul

2.150ul Proteinase K Buffer重悬上述磁珠-抗体复合物

3. 55孵育30min

4. 孵育完之后,将enpendoff管置于磁力架上,将上清液吸入一新的enpendoff管中

5. 于每管上清液中加入250ulRIP Wash Buffer

6. 于每管加入400ul苯酚:氯仿:异戊醇,涡旋震荡15s,室温下14,000rpm离心10min

7. 小心的吸取350ul上层水相,吸入另一新的enpendoff

8. 于每管加入400ul氯仿,涡旋震荡15s,室温下14,000rpm离心10min

9. 小心的吸取300ul上层水相,吸入另一新的enpendoff

10. 每管加入50ul Salt Solution15ul Salt Solution,5ul Precipitate Enhancer 850ul 无水乙醇(无RNase),混合,-80保持1h至过夜

11. 14,000rpm4离心30min,小心去上清

12. 80%乙醇冲洗一次,14,000rpm4离心15min,小心去上清,空气中晾干.

13. 10-20ul DEPC水溶解,-80保存,送测序


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