RNA pull- down实验流程

. 质粒转化、涂板、摇菌

1. JM109感受态细菌80µl,加入1.5mlEP管中,用10µl枪头沾取质粒加入上述EP管中,混匀。

2. 冰上静置30min

3. 42热休克90-120s

4. 迅速移至冰上静置2min

5. 在超净台内,于上述EP管中加入50µl LB培养基(Amp),37160rpm摇床,增菌0.5-1h

6. 菌液4,000rpm离心10min,弃大部分上清,将沉淀重悬,菌液全部加入LB平板(Amp+)上,涂布均匀,37倒置培养(过夜12-15h)。

7. 37培养(12-16h)平板取出,于无菌操作台中挑取单克隆放入内含5ml LB培养基(Amp+)的15ml离心管中,于37250rpm摇床增菌过夜18H,看菌液是否浑浊。菌液浑浊后进行质粒中提。

. 质粒中提(TIANGENDP107-02

1. 柱平衡:向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500µl的平衡液BL12,000rpm离心1min,尽量吸除上清。

2. 1.5ml过夜培养的菌液,加入离心管中,使用常规台式离心机,12,000rpm离心1min,尽量吸除上清。

3. 向留有菌体沉淀的离心管中加入250µl溶液P1使用移液器彻底细菌沉淀。

4. 向离心管中加入250µl溶液P2,温和的上下翻转6-8次使菌体充分裂解。

5. 向离心管中加入350µl溶液P3,立即温和的上下翻转6-8次,充分混匀,此时将出现白色絮状沉淀,12,000rpm,离心10min,此时在离心管底部形成沉淀。

6. 将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中, 12,000rpm,离心30-60sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CP3放入收集管中。

7. 向吸附柱CP3中加入500µl去蛋白液PD12,000rpm离心,离心30-60sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CP3重新放回收集管中。

8. 向吸附柱CP3中加入600µl去蛋白液PW12,000rpm离心,离心30-60sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CP3重新放回收集管中。重复一次。

9. 将吸附柱CP3重新放回收集管中,12000rpm离心2min

10. 将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位滴加50µl洗脱缓冲液EB,室温放置2min12,000rpm离心2min,将质粒溶液收集到离心管中,放冰盒,测浓度。

. 质粒线性化

本实验使用的酶为Biolabs的重组酶Kpn

酶切后进行跑胶。

. 琼脂糖凝胶电泳

1. 配胶。成分:琼脂糖粉、TBEH2O,少量EB

2. TBEH2O混合加入放好琼脂糖粉的锥形瓶中,摇匀,放入微波炉加热1-2min

3. 滴加少量EB,于锥形瓶中摇匀。

4. 倒入胶板中,插入梳子,待琼脂糖凝固。

5. 小心拔掉梳子,取10µl样品加入1µl 10×Loading Buffer缓缓加入点样孔,并在最右边的点样孔加5µlDNA maker

6. 接通电源。

7. 电泳完毕,关闭电源。从胶模中取出琼脂糖凝胶,于紫外灯下切下目的条带。

. 胶回收TIANGENDP214-02

1.向吸附柱CB2中加入500µl平衡液BL12,000rpm离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。

2. 将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中,称取重量。

3. 向胶块中加入等倍体积溶液PC50水浴放置10min左右,其间不断的上下翻转离心管,以确保胶块充分溶解。

4. 将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB212,000rpm离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CB2放入收集管中。

5. 向吸附柱CB2中加入600µl漂洗液PW12,000rpm离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CB2放入收集管中。

6. 重复操作步骤

7. 将吸附柱CB2放入收集管中,12,000rpm离心2min,尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置数分钟,彻底晾干。

8. 将吸附柱CB2放入一个干净的离心管中,向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱缓冲液EB,室温放置2min12,000rpm离心2min,收集DNA溶液。

. 转录以及生物素标记:

1.取无RNA酶管,按下表操作:

1µg线性化DNA

xµl

Biotin RNA Labeling mix

2µl

10×Transcription buffer

2µl

RNA Polymerase

2µl

补足RNase-free水至18µl

2. 取出孵育好的EP管,加入2µlDNase37孵育15min以除去体系中的DNA

3. 取出上述操作的EP管,加入2µl0.2M EDTApH=8.0)终止反应。

4. 1µg Biotin标记的RNA,加入适量Structure Buffer,使得RNA形成二级结构。然后将RNA 95加热2min,冰浴3min,室温静置30min

5. 磁珠准备:使用RIP Wash Buffer 500µl冲洗磁珠3次。

6. 50µl RIP Wash Buffer重悬磁珠,然后将其加入到生物素标记并变性的RNA中,4过夜。

7. 过夜的混合物3000rpm离心1min,去上清。

8. RIP Wash Buffer冲洗3,切记将液体沿壁加入或者滴加,上下缓慢翻转混匀,切勿用移液器吹打。

9. 往磁珠-RNA混合物中加入细胞裂解液,裂解液中加入适量RNase抑制剂,室温放置1h

10. 将孵育好的磁珠-RNA-蛋白混合物低速离心,上清回收,使用RIP Wash Buffer冲洗3次,11ml

11. 于样品中加5×SDS上样缓冲液,95变性10min,跑SDS-PAGE凝胶。

12. 考染:取出SDS-PAGE凝胶于考马斯亮蓝染色液中,摇床过夜。次日用考马斯亮蓝脱色液脱色1~2h,中间更换几次脱色液至条带清晰,背景低为止。

13. 将目的条带切下送测序 (质谱检测)

 


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