3D基因组学：一个崭新的领域

日期：2018-11-15 标签：3D基因组,TAD

倘若仅是回望基因组学本身的发展历程——从1977年首个生物基因组噬菌体φX174序列被测定，到2003年人类基因组计划完成，再到2012年ENCODE计划完成——还不足以代表人类解读生命遗传奥秘的历史。我们更应该回顾和基因组学不分家的遗传学之发展历程。

高中的生物学课堂就已经学到，Gregor Johann Mendel（孟德尔）是遗传学的奠基人，他的“豌豆杂交实验”（1856-1863年），依然是中学生物考题的常用材料。随后，对孟德尔由路转粉的Thomas Hunt Morgan（摩尔根）利用果蝇的突变体，首次确认基因位于染色体上，提出“连锁互换定律”，成为了现代遗传学的奠基人（1908-1915；摩尔根的贡献非常多，这个时间段只是一个粗略的标记）。

对如今的我们来说，不难理解DNA与RNA是携带遗传信息的物质。不过在上世纪中期以前，世人还认为蛋白质才是遗传物质。1928年，Frederick Griffith（格里菲斯）的“肺炎双球菌转化实验”，提出了转化因子学说。但直到1944年，Oswald Avery、Colin MacLeod和Maclyn McCarty三人通过比较蛋白质、多糖与DNA等的转化效应，才逐渐树立了DNA是遗传物质的地位。到了1952年，Alfred Hershey与Martha Chase利用同位素分别标记蛋白质和DNA，最终确认了DNA是遗传物质。

早在DNA发现之初（1869年，Friedrich Miescher），科学家便展开了对其物理结构的鉴定。但一直到1953年，才由James Watson和Francis Crick阐明了DNA的双螺旋结构。

真核生物的基因组含有大量的结合蛋白，包括组蛋白。在原核生物中，也有组蛋白样的DNA结合蛋白。1974-1976年间，科学家首次获得DNA缠绕在组蛋白上的电镜照片（Science. 1974 Jan 25;183(4122):330-2.，Exp Cell Res. 1976 Jan;97:101-10.），并最终在1997年获得结晶结构（Nature. 1997 Sep 18;389(6648):251-60.）。

DNA-组蛋白这种beads on a string“串珠式”的结构，能够显著缩短DNA链在一维水平的尺度，大概7倍。形象一些，对于人类全部DNA而言，将DNA链线性展开，能得到约为2米的长链，再经串珠式压缩，也还有约29厘米。显然，这对于袖珍的细胞核来说，这种结构依然太大了。对染色体的形态观察也提示，DNA与结合蛋白一定形成了更加高级的结构。

2005年，Timothy J. Richmond团队首次报道了chromatin fiber（染色质纤维）的结构。2014年，中国科学家Ping Zhu和Guohong Li小组得到了更加精确的染色质纤维结构。他们的研究都证明，DNA-组蛋白的串珠式结构，还会进一步被压缩成直径仅有30纳米的纤维结构。而在目前的理论模型中，这些染色质纤维还会在包括Cohesin、CTCF等蛋白的帮助之下，扭曲成环，形成更加复杂的结构，最终被压缩成染色体。

讲了半天历史，目的是为了让各位读者能够得到这样一个基本认识：生命体的遗传功能元件，包括编码基因、非编码基因、顺式调控元件等，在空间结构上，并不是在染色体上呈线性地一字依次排开，而是随着DNA形成复杂高级结构的同时，具备了三维组织形式。

为了加深印象，我们不妨再来看下方另外一幅染色体结构的卡通。简而言之，DNA双链就跟纠缠在一起的电话线一般，一圈圈地绕行、压缩，最终形成了染色体。也正因为有这种绕圈圈的压缩方式，我们不难想象，DNA能够密密麻麻地形成许多环状结构。这些环状结构还能再继续绕圈压缩下去。

换句话说，在DNA一维层面上相隔比较远的区域，反而有可能靠得更近。比方说下图中的ABCD四个点，若以A为参照物，C比B远，但由于基因组形成了高级结构，反而把A和C拉得更近。这个示意图还提示了另外一个问题，即同一条染色体上的某些区域，可能很难互相接触，比如B和D之间就，被环状结构给隔开了。

DNA这种相对稳定的高级结构，是由蛋白质来维持的。这同时也为破解基因组的三维结构奠定了技术基础。我们再来利用上面那个ABCD四个小点的图来理解这一项技术。假如说，A和C是帮助DNA凹造型的蛋白，并且它们靠得很近，甚至有蛋白-蛋白相互作用。这时，我们使用甲醛等交联剂，就可以把DNA-结合蛋白以及他们之间形成的高级结构给固定下来。但这种复合物体积非常庞大，为了方便测序建文库，我们需要将DNA利用超声或限制性内切酶打碎。这时候我们得到的，就是许许多多由蛋白质紧紧锁住的包含缺口的小结构。我们再用酶把这些断裂的DNA给修复回去，就会得到许多能够发生相互作用的、具备环状结构DNA了。最后，我们再通过测序的方法就能发现，原本中间隔了个B的A和C位点，居然靠到一起，而C和D虽然很靠近，但却可能测不到它们在一起。

上面所述的方法，便是染色质构象捕获（Chromatin Conformation Capture）技术。大致的流程，可以看下面的图片。最早的技术路线（简称3C，源自英文名首字母），只能研究一个位点对另外一个位点的相互作用（一对一）。而后又发展出了4C（一对全），5C（多对多），Hi-C（全对全），Capture-C（多重一对一）等技术。只是随着复杂度的提高，分辨率也会降低。相关综述可以看这篇文章Unraveling the 3D genome: genomics tools for multi-scale exploration，这里就不详述了。

通过构象捕获技术，从全基因组的角度而言，科学家都得到了什么样的发现呢？

许多小组都发现了一个共同现象：如下图所示，基因组的相互作用，因其三维的物理结构，形成了许多分区。为了读懂这个图，我们需要先理解它是如何绘制。假设线性的染色体座位的蓝、橙、绿三点之间能够发生相互作用，我们就用线段把它们连起来，形成一个等腰三角形，并在线段的交叉点，用颜色的深浅，来代表相互作用的频率，或者说强度。

通过这种方法作图，可以得到许多三角形结构，密集排布在染色体之上。有些小的三角形，颜色比较深，代表着这个三角形内部的相互作用更频繁，同时它们之间甚至有些“泾渭分明”地相邻排布，即甚少与相邻区域发生相互作用，从而形成不同的结构域。科学家将这样的结构域称为Topologically Associating Domain（TAD，中文名姑且翻译为“拓扑相关结构域”）。但又不是说，小结构域之间就绝对不会发生相互作用了，只是频率会比较低。数个相邻且又能发生相互作用的TAD，就形成了Superdomain（超结构域）。随着在染色体上的物理距离增大，相互作用的频率会呈负指数式降低。

TAD里面会是些什么东西呢？

在哺乳动物基因组中，TAD通常由CTCF这个转录抑制因子给分割开来。CTCF还会和Cohesin蛋白复合物结合，帮助基因组形成相对稳定的三维结构。正由于此，两个TAD之间的转录活性是非常低的（转录需要打开DNA），而结合CTCF等转录抑制因子的DNA元件，也被称为insulator（绝缘子）。

不过，在TAD内部可就热闹了。CTCF在帮助基因组DNA凹造型的同时，就把线性展开时距离较远的DNA元件给绑到了一起。而这样相互作用的元件，通常是enhancer（增强子）和promoter（启动子）。

这样做有两个好处。一是缩短了enhancer和promoter之间的空间距离，增强了基因的转录。二是给调控元件合理分区，使得基因转录在不同发育阶段、不同生理条件下，受到特定enhancer的调控。比方说，在胚胎发育早期，干细胞那套基因的表达会占主导。随着发育的进行，表达模式会逐渐替换成特定lineage的基因，再到成熟细胞的基因。倘若没有这样的动态调整的三维分区，这种基因的空间与时序性表达机制，估计就很难实现了。

当然，这里并不是在表达一种设计论的观点。这种精致的调控机制，是在漫长的进化过程中，逐渐选择、适应的结果。

TAD除了形成相对稳定的遗传信息表达功能结构之外，还有其他重要的生物学意义。比如它同样也是细胞周期S期时，DNA复制的结构单元。在不久的将来，科学家还将发现更多的三维基因组功能。

读到这里，我想各位读者应该不难理解，假设基因组的三维结构出了差错，后果可是相当严重。这里本司机举两个例子来说明。

首先，维系正常的基因组三维结构，对保持正常的发育进程有重要的意义。早有文献通过经典的遗传学方法，将F syndrome（表现为手指、脚趾、腭和胸骨发育异常）这种遗传疾病定位到了染色体2q36处。这个区域含有对发育具有重要意义的IHH、WNT6A、WNT10A、PAX3和STK36等基因。如下图所示，最近的研究证明，在有些F syndrome的病例中，WNT6A基因所在的TAD边界染色体区域发生了翻转，使得相邻TAD的增强子跑到WNT6A所在的TAD之中，导致WNT6A异常表达。在小鼠模型中，用CRISPR敲除PAX3基因所在TAD的边界，同样会导致相邻TAD的增强子跑过来调控PAX3，使其表达量异常升高，造成小鼠指骨发育异常。与此对照，用CRISPR敲除相邻TAD内部的序列，不碰及PAX3所在TAD的边缘，PAX3基因的表达水平就不会异常升高，也不会有发育异常现象

第二个例子来自于癌症。肿瘤细胞的基因组是非常混乱的，有许多扩增、缺失和易位。拿原癌基因为例，它的高表达可以来自于原癌基因本身的拷贝数增加，也可以是其表达调控机制得到了增强。这篇综述（Copy number alterations unmasked as enhancer hijackers.）为我们详解，非编码区域拷贝数的异常，是如何导致原癌基因的过度表达的。比如说，MYC基因座位的易位，导致它跑到一个IGH增强子附近（a）。MYB基因附近的染色体区域缺失，把远处的QKI增强子给带到它身边（b）。TAL1所在TAD边缘的染色体区域缺失，导致相邻增强子越俎代庖（e）。IGF2基因座位跨TAD的倍增，导致原本不能调控IGF2的、来自隔壁TAD的增强子，推动了IGF2的表达（f）。其他的机制，就请读者自行读图。而这种现象，科学家将其命名为enhancer hijacking（增强子绑架）。