AGO2在miRNA研究中的应用

日期：2019-03-26 标签：AGO2在miRNA研究中的应用

AGO蛋白在miRNA通路中发挥多种功能。它们通过产生ac-pre-miRNA，参与了miRNA装配的过程，同时它们是RISC效应器蛋白，介导mRNA降解、去稳定作用或者转录抑制。另外，AGO2蛋白可以在转录后调控调节miRNA丰度，内源性Ago2的减少会降低成熟miRNA的表达和活性。Ago2的这个特殊功能是独立于它的剪切功能及内切酶活性的。

1 人类AGO2蛋白

图1 人源AGO2基因染色体及cDNA结构图

尽管所有的Argonaute蛋白都具有Piwi结构域，但并非所有的Argonaute蛋白都具有剪切活性。研究表明，人体内4中AGO蛋白（EIF2C1/hAGO1，EIF2C2/hAGO2，EIF2C3/hAGO3，EIF2C4/hAGO4）中，只有EIF2C2/hAGO2具有剪切活性。进一步研究显示，RNase H酶的活性位点包括一个天冬氨酸-天冬氨酸-谷氨酸/天冬氨酸肽链（Asp-Asp-Glu/Asp motif），正是这段肽链与Mg²⁺结合。人体AGO1及AGO4蛋白中的肽链都和这段保守的天冬氨酸-天冬氨酸-组氨酸肽链不同，而AGO3虽然拥有相同的保守肽链，在体外实验中同样未表现出剪切活性。体外实验中，通过突变改变人体AGO2这段保守序列后，AGO2失去剪切活性。

表1 基因沉默中可能与AGO2相互作用的蛋白

为得到AGO2蛋白具有剪切功能的直接证据，Meister构建了EGFP标记的报告基因。将此报告基因转染Hela细胞，筛选得到稳定表达的细胞株。向此细胞株中转染与报告基因的3’-UTR互不配对的全长miR16。一段时间培养后，实验组（转染miR16）Hela细胞表达的绿色荧光明显减弱，对照组（未转染miR16）荧光无明显变化，证实EGFP标记的此报告基因可被miR16抑制表达。选取实验组细胞，分别敲除AGO1-4。与未敲除细胞相比，敲除AGO1/ AGO3/ AGO4组细胞荧光表达无明显变化；敲除AGO2组细胞荧光表达明显上调。证实在miRNA介导的对靶mRNA的降解过程中，只有AGO2具有剪切活性，能够剪切mRNA。

2 AGO2影响miRNA作用的发挥

（1）AGO2参与miRNA装配过程

在细胞核中，RNA合成酶II或III产生Pri-miRNA转录本，接着Drosha-DGCR8复合物对pri-miRNA进行剪切，获得的前体发夹结构，pre-miRNA，被Exportin-5-Ran-GTP从细胞核转移到细胞质。RNA酶Dicer与双链RNA结合蛋白TRBP的复合物剪切pre-miRNA 为它的成熟长度。成熟miRNA的功能链被Ago2装配到RNA介导沉默复合物RISC上，它引导RISC，通过mRNA剪切、转录抑制或脱腺苷化对靶mRNA进行沉默，而信使链则被分解。

图2 miRNA生产过程的“线性化”经典途径

（2）AGO2的修饰调节AGO2的活性机制

在细胞应激条件下，人AGO2蛋白可以在Ser387残基被p38 MAP激酶磷酸化有助于AGO2定位到处理器processing bodies上。P-bodies是非转录mRNA和与mRNA翻转、转录抑制相关的多种酶系的累积场所，包括AGO2蛋白和miRNAs。

图3 miRNA生产过程因子的调控

（3）RISC装配复合物（RLC）：Dicer、TRBP和PACT与AGO2的连接

RISC是miRNA通路的细胞质效应器，包括一个单链miRNA将它引导至其靶mRNA。细胞质miRNA的处理和RISC的装配都是被RLC所介导。RLC是一个多蛋白复合物，包括RNase Dicer、双链RNA结合蛋白复合物TRBP（Tar RNA binding protein）和PKR的蛋白激活物PACT，其核心组分为AGO2，介导RISC作用于mRNA靶位点。

Dicer和TRBP相互作用，而后被Ago2招募，形成三体复合物，结合被转运的pre-miRNA组成RISC装配复合物RLC。

图4 Dicer、TRBP与AGO2的连接

（4）AGO2介导pre-miRNA的剪切：ac-pre-miRNA

由于miRNA的发夹茎环结构上序列互补程度非常高，在Dicer介导的序列剪切之前需要一个额外的内切核苷酸的剪切步骤：AGO2的剪切功能被激活，剪切发夹结构的3’ 臂——预期为信使链的中间，得到一个带缺口的发夹架构，产生AGO2-剪切的miRNA前体或称为ac-pre-miRNA。Dicer处理这个前体和pre-miRNA的效率是一样的。

图5 AGO2介导pre-miRNA的剪切

3 AGO2的实验应用

AGO2是RISC的核心组分，联系着miRNA和它们的mRNA靶位点。因此，在合适的条件下对AGO2的免疫纯化（IP）可以获得相互结合的miRNA和mRNA，从而识别miRNA的靶位点。还可以进行免疫荧光，检测三者复合物在细胞内的定位。

图6 结合AGO2的RNA的系统分选与鉴定