Exosomes Derived from Hypoxic Oral Squamous Cell Carcinoma Cells Deliver miR-21 to Normoxic Cells to Elicit a Prometastatic Phenotype

日期：2016-09-10 标签：exosome

（Cancer research IF 8.5 March 18, 2016）

下载链接：https://yunpan.cn/cksCPCQmUgtSD （提取码：77ea）

文章摘要

实体瘤的缺氧与侵袭和不良预后相关。作者发现，缺氧口腔鳞癌细胞（OSCC）来源的外泌体，能在HIF1α和HIF2α参与下增加OSCC细胞的侵袭和迁移作用。已知外泌体能携带转运miRNA来改变细胞功能，通过实验，作者发现了一个miR-21，在缺氧环境下其表达显著上调，而在缺失miR-21的情况下，能降低外泌体中miR-21的丰度，最终能抑制细胞的迁移和侵袭作用。外泌的miR-21能显著增加Snail蛋白（EMT转化的明星蛋白）和波形蛋白的表达，降低OSCC细胞的E-钙粘素。

所以，这表明缺氧微环境能刺激细胞生成更多富含miR-21的外泌体，并且这些外泌体将miR-21转移到正常氧含量的细胞中，促进预转移行为。

主要内容：

1、外泌体的分离、鉴定与功能验证

作者通过ExoQuick外泌体抽提试剂盒沉淀分离出来。前面讲过，分离后的外泌体需要检测是真的外泌体，而非其他小囊泡。

通过扫描式电子显微镜观察，发现分离出来的囊泡大小为50-200nm，这个符合要求。其次检测外泌体marker -CD63、CD81，也检测到了。这表明分离出来的的确是外泌体。

外泌体筛选好后，接着就是检测它的功能。

伤口愈合实验（细胞划痕实验）表明，缺氧肿瘤细胞来源的外泌体能加速细胞迁移，并且这种作用跟HIF1α和HIF2α的表达相关。另外，使用缺氧OSCC细胞来源的外泌体，也能增加正常氧含量细胞的侵袭作用。

2、外泌体携带分子筛选及功能验证

众所周知，外泌体能携带miRNA及mRNA去改变细胞的功能。这里作者关注了miRNA。

通过RNA-seq，作者获得了大量RNA信息，其中miRNA量占缺氧和正常含氧细胞来源外泌体携带RNA的11%和37%，接着通过对比miRBase数据库，分别找到223、288个具有代表性的miRNA。这些miRNAs中，有214个在两组中都存在的。接下来，热图表明有108个miRNA表达具有差异（倍数变化>2），这其中有105个是在缺氧外泌体中是上调的。最终选择了三个miRNA-miR-21, miR-205,  miR-148b进行后续的验证，通过缺氧处理，这三个miRNA在细胞分泌的外泌体中表达显著上升。

3、锁定目标分子，研究它的机制

第二部分实验确定了三个分子，最终，作者选择了miR-21。

第一部分内容，发现外泌体调控细胞迁移侵袭作用与HIF1α和HIF2α（缺氧诱导因子）有关，而这里又选了miR-21做主角，那就继续在它们之间找关系。

果然，miR-21与HIF1α和HIF2α的作用关系和缺氧OSCC细胞来源的外泌体一样。在缺氧条件下，miR-21的表达依赖着HIF1α和HIF2α的表达。

有上述实验其实就暗示了，缺氧OSCC细胞来源的外泌体通过了miR-21介导了细胞的迁移和侵袭作用。

敲减miR-21能明显降低细胞的迁移和侵袭作用。

而rescue实验则能恢复细胞的侵袭迁移作用。

这里作者还提及到，miR-21的表达能促进EMT作用，提高波纹蛋白的表达。

4、体内实验（动物实验）

敲减miR-21能抑制肿瘤体积，阻遏肿瘤细胞淋巴结转移。

上面提到了miR-21与EMT相关。作者就简单做了一下EMT相关蛋白，以及miR-21的靶蛋白表达关系。敲减缺氧OSCC细胞外泌体中的miR-21能恢复E-钙粘素的表达（上皮marker），表明敲减miR-21抑制了EMT。

5、临床意义

外周血中miR-21与OSCC病人的淋巴结转移相关。 研究发现，OSCC病人血浆中外泌体中miR-21明显高于正常受试者，其表达水平与肿瘤分期及淋巴结转移密切相关。此外，外周血中分泌的miR-21也与HIF1α和HIF2α相关。

临床病理特征信息。作者把108个口腔鳞癌病人的病理参数进行分析，发现miR-21与T、N分期、HIF1α、HIF2α显著相关。

总之，外泌体研究分为以下几步：a、分离外泌体，b、鉴定外泌体，c、外泌体功能研究，d、挑选外泌体携带的分子，e、研究该分子功能，与外泌体功能一致，f、外泌体及分子水平的动物实验，g、临床相关性