A Long Non-coding RNA ，LncMyoD ，Regulates SKeletal Muscle Differentiation by Blocking IMP2-Mediated mRNA Translation

日期：2017-07-15 标签：LncMyoD

mRNA翻译调控研究案例（一）

（一）调控通路图：

    MyoD结合到LncRNA MyoD启动子上促进LncRNA MyoD的表达，然后LncRNA MyoD通过与mRNA结合蛋白IMP2结合，使其不能结合到mRNA上，从而抑制mRNA的翻译。

（二）实验流程：

作者首先通过分化的骨骼肌细胞和未分化细胞的RNA-seq分析筛选出LncRNA MyoD,然后进行q-pcr验证在肌小管细胞中LncMyoD高表达。随后对LncMyoD进行功能实验和调控机制研究。

LncMyoD功能研究：首先建立LncMyoD过表达/敲低稳定细胞株，检测过表达/敲低后的与细胞分化相关基因的表达以及细胞增殖分化检测。

调控机制研究：（1）蛋白MyoD与LncMyoD启动子结合促进LncMyoD表达，作者用CHIP和启动子荧光素酶实验检测两者的关系。（2）LncMyoD结合Mrna结合蛋白IMP2抑制靶标mRNA表达：先用RNA pull-down和RIP验证LncMyoD与IMP2结合，然后对LncMyoD敲低后的细胞分别用QRT-PCR和WB检测靶标mRNA和蛋白的表达，用IMP2抗体在不同培养时间点进行RIP实验检测结合的RNA，表明LncMyoD与IMP2靶标mRNA竞争结合IMP2。

（三）核心FIGURE：

Figure1说明的是MyoD蛋白结合的LncMyoD的启动子上并促进LncMyoD的表达。

A、通过MyoD蛋白的过表达和敲低，用 qRT-PCR检测LncMyoD的表达情况。表明MyoD促进LncRNA MyoD的表达。

B、通过荧光素酶验证LncMyoD启动子受MyoD的诱导激活下游基因的转录。

C、CHIP实验，用蛋白MyoD抗体钓取与MyoD结合的DNA片段，联用Q-PCR检测蛋白与LncMyoD启动子的结合区域。结果表明MyoD结合到LncRNA MyoD启动子的Primer1和Primer4区域。

Figure2说明的是LncMyoD与IMP2靶标mRNA竞争结合IMP2从而降低这些靶标基因的表达。

A、 RNA pull-down，用LncMyoD探针钓取与LncMyoD结合的蛋白，用IMP2抗体进行WB验证LncMyoD与蛋白IMP2结合。

B、 RIP用IMP2抗体从LncMyoD敲低和未敲低细胞中钓取与IMP2结合的RNA，用Q-PCR检测RIP产物，结果表明LncMyoD敲低后与IMP2结合下降。

C、 RIP，用IMP2抗体从LncMyoD敲低和未敲低细胞中钓取与IMP2结合的RNA，用Q-PCR检测产物中的IMP2靶标mRNA，结果表明LncMyoD敲低后，IMP2与其靶标Mrna的结合上升。

D、 RIP，用IMP2抗体在不同时间点从细胞中钓取与IMP2结合的RNA，然后检测产物中的相关RNA，表明LncMyoD与IMP2靶标mRNA竞争结合IMP2。

本公司可提供的技术服务项目

本公司可进行类似实验的实验设计及整体实验外包项目，包括Q-PCR、慢病毒稳转株的建立（过表达/敲低）、Luciferase检测、CHIP、RNA pull-down、WB、RIP，其中Luciferase检测、CHIP、RNA pull-down、RIP为本公司主营项目。

一、Luciferase检测：检测转录因子和其靶启动子中的特异序列结合的重要手段

本实验用MyoD蛋白表达质粒和LncMyoD启动子荧光素酶报告质粒转染细胞检测启动子活性，实验结果表明随着MyoD表达升高LncMyoD启动子活性增强，说明了MyoD对LncMyoD启动子的激活。证明了MyoD对LncMyoD启动子的激活作用。

二、CHIP技术：主要研究蛋白与RNA的相互作用

本实验验证了LncMyoD启动子与MyoD结合的区域。用MyoD抗体进行CHIP获取与MyoD蛋白结合的DNA片段，然后用LncMyoD启动子不同区段的引物进行Q-PCR检测，说明了LncMyoD启动子与MyoD结合的区域在P1和P1区域。

三、RNA pull-down：检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间相互作用的主要实验手段之一。

       本实验用LncMyoD探针钓取与RNA结合的蛋白，然后对产物进行WB验证，说明了LncMyoD与IMP2的结合关系。我公司在实验体系中同时提供lncRNA正义链与反义链的pull down。

四、RIP技术：主要研究蛋白与RNA的相互作用

   用IMP2抗体进行RIP实验获取不同时期与IMP2结合的RNA，然后进行Q-PCR检测产物中的RNA，随时间推移与IMP2结合的LncMyoD呈上升趋势，而IMP2的靶标mRNA结合越来越少，说明了LncMyoD竞争性的结合IMP2是IMP2不能结合到靶标mRNA上。

参考文献：Chenguang Gong, Zhizhong Li, Krishnan Ramanujan，et al.A Long Non-coding RNA, LncMyoD, Regulates Skeletal Muscle Differentiation by Blocking IMP2-Mediated mRNA Translation［J］. Developmental Cell,2015,34, 181–191