1：RIP试验需要注意什么？

（1）防止RNA与蛋白非特异性结合。（2）避免RNA蛋白质结合被破坏。

（3）避免外源RNase污染。        （4）抑制内源RNase的活性。

（5）选择适合做RIP的抗体。      （6）避免RNA结合蛋白的降解。

2：为什么抗体无法沉淀RIP裂解液中的目标蛋白？

（1）先进行IP或者WB，测试抗体可以与目标RBP结合。

（2）另选一个能与抗原其他表位结合的抗体。

（3）尽可能选用密理博RIPAb+抗体。

（4）稀释抗体成浓度梯度，进行IP测试。

（5）4℃过夜孵育抗体与RIP裂解液。

（6）确定抗体类型与Protein A/Protein G匹配。

3：提取RNA时，蛋白酶K消化不完全是什么原因？

当进行蛋白酶K消化时，确保水浴温度应设置在55℃左右，长期在65℃以上孵育会导致蛋白酶K失活。

4：提取RNA后，A260/A280比值偏离1.8~2.2区域是什么原因？

（1）需要缩短酚氯仿提取RNA的时间间隔。

（2）测试提纯后RNA中是否存在RNA酶，可能RNA发生了降解。

5：做RIP的时候和beads孵育的lysate的浓度如何确定？有些动物的文献提到用细胞板数细胞个数，想知道如果用蛋白浓度的话，大概在什么数量范围的蛋白总量对应50 ul BEADS?

50 ul beads对应的是一个reaction，而我们推荐一个reaction是100ul裂解上清（2×107 cells加入100ul RIP lysis buffer得到），所以只需要在裂解前计数一下，并按括号中的比例加入裂解buffer，后续100 ul 裂解上清就是一个reaction的蛋白用量。不建议通过裂解后测蛋白浓度的方法进行配比。

6：RIP可以分提核浆的RNA-蛋白质复合物吗？

理论上，可以采用能分别抽提核浆蛋白的蛋白抽提kit先分离样本，再进行RIP实验。但需要特别注意的是所用kit中的reagent不能有RNase和DNase，以及要能与下游的抗体beads孵育兼容。

7：因为RIP做完得到的是RNA序列，要做后续检测，比如测序、判断目标序列位置等，是不是都必须要做RT-PCR，得到逆转录的DNA后，后面就跟ChIP相同了？

常见的用real time qRT-PCR。如果对照的目的是保证两个样品间加入的细胞量一致或者进行定量，理论上说，使用input作为判别，计算不同样品上样量的差异。如果对照的目的是为了看IgG以及目的抗体富集的非特异性mRNA的量的话，那么可以找一个确定不会与目的抗体结合的RNA片段设计primer进行qPCR，用来看IgG以及目的抗体拉下来的背景情况。RIP可以看成是普遍使用的染色质免疫沉淀ChIP技术的类似应用，但由于研究对象是RNA-蛋白复合物而不是DNA-蛋白复合物，RIP实验的优化条件与ChIP实验不太相同（如复合物不需要固定，RIP反应体系中的试剂和抗体绝对不能含有RNA酶，抗体需经RIP实验验证等等）

• 1 . miRNA的概述
  • 1.1. miRNA的生物发生
  • 1.2. miRNA的作用机制
  • 1.3. miRNA的研究展望
  • 1.4. miRNA与癌症
  • 1.5. miRNA在转化医学中的应用
• 2 . lncRNA的概述
  • 2.1. lncRNA的研究背景
  • 2.2. lncRNA的作用机制
  • 2.3. lncRNA的研究展望
  • 2.4. lncRNA与癌症
  • 2.5. lncRNA与临床疾病
• 3 . miRNA与lncRNA研究策略
  • 3.1. miRNA的一般研究策略
  • 3.2. AGO2在miRNA研究中的应用
  • 3.3. LncRNA的一般研究策略
  • 3.4. miRNA与lncRNA的生物信息学预测
• 4 . miRNA与lncRNA研究实验
  • 4.1. RNA 结合蛋白免疫沉淀技术（RIP）Model Figures
  • 4.2. RNA结合蛋白免疫沉淀技术（RIP）实验流程
  • 4.3. RNA结合蛋白免疫沉淀技术（RIP）实验常见问题
  • 4.4. RNA pull - down Model Figures
  • 4.5. RNA pull- down实验流程
  • 4.6. RNA pull- down实验常见问题
  • 4.7. 荧光素酶检测技术（Luciferase）Model Figures
  • 4.8. 荧光素酶检测技术（Luciferase）实验流程
  • 4.9. 荧光素酶检测技术（Luciferase）实验常见问题