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一. 质粒转化、涂板、摇菌
1. 取JM109感受态细菌80µl，加入1.5mlEP管中，用10µl枪头沾取质粒加入上述EP管中，混匀。
2. 冰上静置30min。
3. 42℃热休克90-120s。
4. 迅速移至冰上静置2min。
5. 在超净台内，于上述EP管中加入50µl LB培养基（Amp－），37℃，160rpm摇床，增菌0.5-1h。
6. 菌液4,000rpm离心10min，弃大部分上清，将沉淀重悬，菌液全部加入LB平板（Amp+）上，涂布均匀，37℃倒置培养（过夜12-15h）。
7. 将37℃培养（12-16h）平板取出，于无菌操作台中挑取单克隆放入内含5ml LB培养基（Amp+）的15ml离心管中，于37℃、250rpm摇床增菌过夜18H,看菌液是否浑浊。菌液浑浊后进行质粒中提。
二. 质粒中提（TIANGEN，DP107-02）
1. 柱平衡：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500µl的平衡液BL，12,000rpm离心1min，尽量吸除上清。
2. 取1.5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000rpm离心1min，尽量吸除上清。
3. 向留有菌体沉淀的离心管中加入250µl溶液P1使用移液器彻底细菌沉淀。
4. 向离心管中加入250µl溶液P2，温和的上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
5. 向离心管中加入350µl溶液P3，立即温和的上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀，12,000rpm，离心10min，此时在离心管底部形成沉淀。
6. 将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中， 12,000rpm，离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。
7. 向吸附柱CP3中加入500µl去蛋白液PD，12,000rpm离心，离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。
8. 向吸附柱CP3中加入600µl去蛋白液PW，12,000rpm离心，离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。重复一次。
9. 将吸附柱CP3重新放回收集管中，12000rpm离心2min。
10. 将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50µl洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm离心2min，将质粒溶液收集到离心管中，放冰盒，测浓度。
三. 质粒线性化：
本实验使用的酶为Biolabs的重组酶KpnⅠ。
酶切后进行跑胶。
四. 琼脂糖凝胶电泳
1. 配胶。成分：琼脂糖粉、TBE、ⅠH2O，少量EB。
2. TBE与H2O混合加入放好琼脂糖粉的锥形瓶中，摇匀，放入微波炉加热1-2min。
3. 滴加少量EB，于锥形瓶中摇匀。
4. 倒入胶板中，插入梳子，待琼脂糖凝固。
5. 小心拔掉梳子，取10µl样品加入1µl 的10×Loading Buffer缓缓加入点样孔，并在最右边的点样孔加5µlDNA maker。
6. 接通电源。
7. 电泳完毕，关闭电源。从胶模中取出琼脂糖凝胶，于紫外灯下切下目的条带。
五. 胶回收（TIANGEN，DP214-02）
1.向吸附柱CB2中加入500µl平衡液BL，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
2. 将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量。
3. 向胶块中加入等倍体积溶液PC，50℃水浴放置10min左右，其间不断的上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。
4. 将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。
5. 向吸附柱CB2中加入600µl漂洗液PW，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。
6. 重复操作步骤⑤。
7. 将吸附柱CB2放入收集管中，12,000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干。
8. 将吸附柱CB2放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm离心2min，收集DNA溶液。
六. 转录以及生物素标记：
1.取无RNA酶管，按下表操作：
1µg线性化DNA | xµl |
Biotin RNA Labeling mix | 2µl |
10×Transcription buffer | 2µl |
RNA Polymerase | 2µl |
补足RNase-free水至18µl | |
2. 取出孵育好的EP管，加入2µl的DNaseⅠ，37℃孵育15min以除去体系中的DNA。
3. 取出上述操作的EP管，加入2µl0.2M EDTA（pH=8.0）终止反应。
4. 取1µg Biotin标记的RNA，加入适量Structure Buffer,使得RNA形成二级结构。然后将RNA 95℃加热2min，冰浴3min，室温静置30min。
5. 磁珠准备：使用RIP Wash Buffer 500µl冲洗磁珠3次。
6. 用50µl RIP Wash Buffer重悬磁珠，然后将其加入到生物素标记并变性的RNA中，4℃过夜。
7. 过夜的混合物3000rpm离心1min，去上清。
8. RIP Wash Buffer冲洗3次，切记将液体沿壁加入或者滴加，上下缓慢翻转混匀，切勿用移液器吹打。
9. 往磁珠-RNA混合物中加入细胞裂解液，裂解液中加入适量RNase抑制剂，室温放置1h。
10. 将孵育好的磁珠-RNA-蛋白混合物低速离心，上清回收，使用RIP Wash Buffer冲洗3次，1次1ml。
11. 于样品中加5×SDS上样缓冲液，95℃变性10min，跑SDS-PAGE凝胶。
12. 考染：取出SDS-PAGE凝胶于考马斯亮蓝染色液中，摇床过夜。次日用考马斯亮蓝脱色液脱色1~2h，中间更换几次脱色液至条带清晰，背景低为止。
13. 将目的条带切下送测序 (质谱检测)。