Cas9基因敲入(knock in)

图1基因敲入原理图

1. 设计sgRNA-Cas9及修复DNA模版

2 .构建sgRNA-Cas9质粒及修复DNA模板质粒

3 .将sgRNA-Cas9、修复DNA模版共转293T细胞

4. 嘌呤筛选，检测荧光

5 .PCR检测基因组，RFP蛋白是否敲入

   针对人类AAVS1 AAVS1 Safe Harbor基因设计了sgRNA进行软件分析以确保sgRNA没有预测的脱靶结合位点。设计DNA修复模版，两侧同源臂，其两侧各有600bp的同源臂。

    将选定的sgRNA设计与CMV启动子驱动的Cas9基因一起克隆到pCas-Guide中以制备pCas-Guide-AAVS1（图2）

将DNA修复模板插入含有RFP-嘌呤霉素的pAAVS1-RFP-DNR表达载体（图2）。

 图2 sgRNA-Cas9质粒及修复DNA模版质粒

    用lipofectmine2000转染试剂将上述两种质粒转染至293T细胞。

     嘌呤筛选3-4周

     3-4周后，> 95％的HEK293细胞表达RFP（图3）。

图3 荧光检测图片  A转染筛选后明场图片   B转染筛选后荧光图片 C未转染加嘌呤筛选细胞

    为了证实在基因组DNA中敲入RFP，设计引物对，引物1靶向RFP上游的5'同源臂和靶向RFP-嘌呤霉素基因内的引物2。

1.1kb的PCR产物表明在AAVS1位点敲入成功; 没有PCR扩增指示敲入不成功（图4）。

    在对照细胞（'WT细胞'）中没有看到PCR扩增。

• 1 . CRISPR-Cas9基因沉默
• 2 . CRISPR-Cas9基因敲入
• 3 . dCas9定点调控表达
• 4 . dCas9定点调控表观遗传
• 5 . dCas9介导转录调控