CRISPR-Cas9系统

CRISPR Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats CRISPR-Associated Proteins 9）是最近几年兴起用于靶向基因特定DNA修饰的重要工具。

CRISPR Cas9

    CRISPR Cas9系统最初在细菌和古细菌中被发现，是一种细菌应对外来病毒或质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。当外源DNA首次侵入细菌时，外源DNA被Cas核酸酶切割，并以间隔序列形式整合到CRISPR基因座中（图1-a）。 当外源DNA再次入侵时，细菌会以间隔序列作为模板形成短的CRISPR RNA（crRNA），crRNA与反式激活crRNA（tracrRNA）形成复合RNA：该复合RNA作为引导链指导Cas9核酸酶结合到互补的外源DNA。 一旦结合，Cas9蛋白通过其NHN和RuvC1样核酸酶结构域分别切割外源DNA的两条链（图1-b），使外源DNA降解。

Figure 1 ：The CRISPR Locus and its use as an adaptive immune system. a) Invading DNA are cleaved by the CAS gene products and incorporated into the CRISPR Locus as spacer sequences. Different spacer sequences are separated by conserved repeat sequences. b) Once the same invading DNA is detected in the cell, the spacer DNA is expressed in the form of crRNA. The crRNA then complexes with tracrRNA and guides the Cas endonuclease to the foreign DNA for degradation.

  迄今为止，已经发现了45种不同的Cas蛋白家族，每种家族在crRNA的合成、间隔序列的整合以及外源DNA的切割方式上有明显的不同。 根据Cas9蛋白的序列和结构不同，CRISPR-Cas9分为三类：I型，II型和III型。 目前常用于基因组编辑的CRISPR Cas9系统是改良自酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）的II型CRISPR Cas系统。

• 1 . CRISPR-Cas9系统
  • 1.1. CRISPR-Cas9组成
  • 1.2. 作用机制
  • 1.3. 不同的Cas9系统
  • 1.4. Cas9-基因敲除
  • 1.5. Cas9-敲入系统
• 2 . CRSPER- dCas9系统
  • 2.1. dCas9-转录调控系统
  • 2.2. dCas9-基因激活与抑制系统
  • 2.3. dcas9-表观遗传系统
• 3 . dCas9技术路线
  • 3.1. gRNA设计
  • 3.2. dCas9实验流程
  • 3.3. 实验问题与解决方案