CRISPER-Cas9系统的组成

CRISPR Cas9靶向基因组编辑系统有两个组成部分：①内切核酸酶-Cas9和②指导RNA-gRNA（图2）。内切核酸酶是来自酿脓链球菌的Cas9核酸酶蛋白。 Cas9核酸酶具有切割双链DNA的活性结构域（RuvC1和HNH样核酸酶结构域），使得双链DNA断裂。 gRNA是由起支架功能的tracrRNA与特异性的crRNA结合形成的嵌合RNA。后来，人们将这两段RNA拼接成一条短RNA，称为sgRNA。 gRNA 5'末端的20bp是特异性的结合序列-寻靶装置，通过RNA-DNA碱基配对将Cas9 / gRNA复合物募集到特异的DNA靶点。特异性结合序列相邻的是PAM（Protospacer Adjacent Motif）基序。PAM基序是内切核酸酶Cas9的识别位点，Cas9的PAM基序为5'-NGG。Cas9核酸酶在PAM基序上游第3个碱基处切割双链DNA。

Figure 2 ：The last 20 base pairs of the gRNA acts as a homing device, recruiting the Cas9 endonuclease to the appropriate target sequence. Once there, the two cleavage domains of the Cas9 create a double stranded break 3 or 4 base pairs downstream of the PAM sequence. The DSB is then repaired by either the error-prone non-homologous end joining repair pathway, or the template-dependent homology directed repair

• 1 . CRISPR-Cas9系统
  • 1.1. CRISPR-Cas9组成
  • 1.2. 作用机制
  • 1.3. 不同的Cas9系统
  • 1.4. Cas9-基因敲除
  • 1.5. Cas9-敲入系统
• 2 . CRSPER- dCas9系统
  • 2.1. dCas9-转录调控系统
  • 2.2. dCas9-基因激活与抑制系统
  • 2.3. dcas9-表观遗传系统
• 3 . dCas9技术路线
  • 3.1. gRNA设计
  • 3.2. dCas9实验流程
  • 3.3. 实验问题与解决方案