CRISPR-Cas9系统的作用机制

CRISPR Cas9系统产生双链DNA缺口后，生物体内一般通过非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）这两种修复方式对断裂的双链DNA进行修复。

◆ 修复方式一：非同源末端连接修复途径（NHEJ）

        NHEJ修复途径是一种错误倾向修复机制，用于在缺少修复模板的情况下修复断裂的双链DNA。该途径主要用于CRISPR Cas9系统介导的基因沉默。主要用于当DNA发生断裂时，NHEJ修复途径被开启，DNA断裂处插入或缺失几个碱基，然后双链DNA的切割末端连接在一起，这个过程极容易导致切割位点发生移码突变，从而沉默该基因（图3）。因此，在沉默编码基因时， gRNA应靶向基因的N端来确保最大程度的基因破坏。

Figure 3 ：The non-homologous end joining repair mechanism attempts to ligate the ends of the DSB together without the use of a homologous template. This process is error prone as the loss or addition of a few nucleotides is inevitable with this mechanism. As a result NHEJ creates InDel mutations which either disrupt the reading frame of the gene or introduce premature stop codons.

◆ 修复方式二：同源性定向修复（HDR）

    对比NHEJ修复途径，同源性定向修复（HDR）途径是更为精确的修复机制。 这种修复机制主要用于CRISPR Cas9系统介导的基因敲入。 在该修复路径中，需要将一段与预期编辑位点上下游紧邻序列具有高度同源性的DNA修复模板、特异的gRNA和Cas9核酸酶一起引入细胞中。 在高度同源性DNA模板存在的情况下， HDR机制可以通过同源重组将一段DNA插入编辑位点（图4）。这种修复方式可以将一段DNA序列精准地插入特定的基因组位点。

Figure 4 ： In the presence of a suitable repair template containing homology arms directly upstream and downstream of the double stranded break, the recombination-based homology directed repair mechanism is used. In this way precise changes—be it additions or deletion—can be made anywhere in the genome.

• 1 . CRISPR-Cas9系统
  • 1.1. CRISPR-Cas9组成
  • 1.2. 作用机制
  • 1.3. 不同的Cas9系统
  • 1.4. Cas9-基因敲除
  • 1.5. Cas9-敲入系统
• 2 . CRSPER- dCas9系统
  • 2.1. dCas9-转录调控系统
  • 2.2. dCas9-基因激活与抑制系统
  • 2.3. dcas9-表观遗传系统
• 3 . dCas9技术路线
  • 3.1. gRNA设计
  • 3.2. dCas9实验流程
  • 3.3. 实验问题与解决方案