不同的CRISPR系统

    Cas9核酸酶共有两种突变体：Cas9 Nickase（单突变）和dCas9（双突变）。

✩Cas9 Nickase

        CRISPR Cas9技术的潜在脱靶效应可能是由Cas9核酸酶活性引起的。 为了改善由Cas9核酸酶活性引发的脱靶效应，开发了Cas9 Nickase。 Cas9 Nickase是Cas9的突变形式， 是由RuvC1和 HNH两个核酸酶活性区域中其中一个核酸酶活性区域突变而成。 这种突变形式产生单链缺口而不是在靶位点的双链断裂。（图6）

    利用Cas9 Nickase进行基因组编辑，需要两个gRNA而不是一个。 两个gRNA将被设计在相反的DNA链上且紧密接近（序列相距不超过20bp），以确保一旦两条链被Cas9 Nickase切割时，就会产生DNA双链断裂。 这种配对的Cas9 Nickase减少了脱靶效应，因为两个gRNA需要一起作用才能产生DNA的双链断裂（图7）。一旦双链DNA断裂，NHEJ或HDR路径将被激活以完成基因组编辑过程。

Figure 6 ：The Cas9 nickase is a mutant form of the Cas9 nuclease where one of its cleavage domains has been disabled. Using Cas9 Nickase, off-target effects of the wild type Cas9 can be minimize, since the nicks in the DNA rarely lead to InDel mutations.

Figure 7 ： When using paired Cas9 nickases additional considerations need to be given to the gRNA design. These include producing a 5’ overhang, the spacing between the two gRNAs, and the relative position of the two gRNA target sites.

✩dCas9

    dCas9的英文为dead Cas9，即Cas9的RuvC1和 HNH两个核酸酶活性区域同时发生突变。因此，dCas9只保留由gRNA引导进入基因组的能力，剪切酶活性全部消失。dCas9主要是与其他效应蛋白融合（如GFP、转录因子、组蛋白修饰等），进行基因调控，基因组成像，染色质或DNA修饰以及染色质免疫沉淀等。

Figure 8 ：The Cas9 null mutant has lost both of its DNA cleavage domains while still retaining its ability to target genomic loci through gRNA:DNA interactions. By fusing effector domains to the Cas9 null mutant, it is possible to activate gene expression (i.e. V964 or NF-kB), repress gene expression (i.e. KRBA domain), visualize genomic loci (i.e. EGFP), perform chromatin remodelling (i.e. TET proteins), and simplify chromatin immunopercipitation (through an antibody epitope tag)

    为了解决spCas9的局限性，即其大尺寸和富含G的PAM序列，已经研究出几种 CRISPR酶作为潜在替代物，最显着的是Cpf1和saCas9。表3总结了spCas9，saCas9和Cpf1之间的一些重要差异和相似之处。

Table 3: Comparison of spCas9, saCas9, and Cpf1 nucleases

✰Cpf1核酸酶

     2015年末，麻省理工学院的张峰小组发现了一种新的CRISPR核酸酶Cpf1。Cpf1可以识别富含T的PAM基础，与富含G的PAM -Cas9相比，这显着扩大了基因组靶标的广度。因此，Cas9是富含G的基因组区域的首选核酸酶，而 Cpf1主要用于靶向富含T的基因组

   与Cas9相比，Cpf1的gRNA更短一些， Cas9的gRNA是约100nt的tracrRNA / crRNA杂合体，而Cpf1的gRNA是仅有42nt的 crRNA。这将gRNA的大小减少了一半以上，同时也简化了与合成和化学修饰相关的方法和节约了成本，也使得Cpf1成为复合基因组编辑的最佳选择，即可将多个gRNA插入同一载体并进行同步基因编辑。

      Cpf1切割位于PAM位点下游18-23bp的DNA， NHEJ修复断裂的双链DNA后识别序列不中断。因此，Cpf1能够进行多轮DNA切割，增加了产生基因组编辑的机会。相比之下， Cas9在PAM位点上游3bp切割，NHEJ修复双链DNA后识别序列会被破坏。

✰saCas9核酸酶

     saCas9从金黄色葡萄球菌中分离的微型Cas9核酸酶。

     SaCas9比spCas9小约1kb，这使其能够更有效地包装进较小容量的腺病毒（AAV）中，为调节元件，crRNA和tracrRNA留下额外的空间。也使得将Cas9与gRNA构建到一个载体上成为可能，称为All-In-One载体。

      spCas9识别5'-NGG-3'的PAM序列，而saCas9识别5'-NNGRRT-3'。PAM序列的更多变意味着可用于基因组编辑的基因座数目增加。当需要使用同源性定向修复的基因的精确编辑时，这是特别有益的，因为当识别序列非常接近待编辑区域时HDR是最有效的。saCas9更长的PAM的一个缺点是，这个序列在基因组中比spCas9的PAM序列发生基因编辑的可能性小，限制了它的潜在效用。但是，saCas9较长的PAM序列增加了识别的特异性，有助于防止脱靶效应

• 1 . CRISPR-Cas9系统
  • 1.1. CRISPR-Cas9组成
  • 1.2. 作用机制
  • 1.3. 不同的Cas9系统
  • 1.4. Cas9-基因敲除
  • 1.5. Cas9-敲入系统
• 2 . CRSPER- dCas9系统
  • 2.1. dCas9-转录调控系统
  • 2.2. dCas9-基因激活与抑制系统
  • 2.3. dcas9-表观遗传系统
• 3 . dCas9技术路线
  • 3.1. gRNA设计
  • 3.2. dCas9实验流程
  • 3.3. 实验问题与解决方案