CRISPR dCas9—基因激活与抑制系统

   在第一代dCas9-SAM系统中，dCas9与典型的转录激活因子如VP64（单纯性疱疹病毒蛋白16的合成四聚体）或p65（参与许多细胞过程的转录因子）融合。这个系统可以在多种真核细胞的全基因组范围内进行基因激活，但只有中等程度的激活（2-5倍）。

   为了增强激活能力，开发了二代dCas9-SAM系统。该系统建立在基本的dCas9-VP64结构上，但其中的sgRNA是经修饰过的，可以募集额外的转录激活因子以达成协同激活作用。这种修饰的sgRNA包含了两段可结合噬菌体MS2外壳蛋白二聚体的发卡结构。 MS2蛋白与另外的活化剂如p65和人热休克因子1（HSF1）融合，这使得每个dCas9分子可以募集13个活化分子（图2a）。这个新的dCas9-SAM系统可以可靠地将基因表达从10倍增加到几千倍（图2b）。由于这个系统需要设计修饰的sgRNA，人们开发了第三代dCas9-SAM系统，也称为dCas9-VPR系统。这个系统由VP64，p65和RTA融合而成，且不需要修改的sgRNA。因此，这大大简化了设计过程。当与sgRNA文库结合使用时，该系统还能够支持大规模的全基因组功能激活，使其成为研究生物学过程和途径的有力工具。

   dCas9-SAM系统是一种，在不改变内源基因组的条件下，可以选择性地上调特定靶基因表达的简便方法。由于其强大的激活能力，该系统将成为跨越多种细胞类型的治疗性干预、基因筛选工具。研究人员已经开始利用dCas9-SAM系统激活HIV-1转录，诱导细胞凋亡以及诱导休HIV-1前病毒休眠。

Figure 2 ： The dCas9-SAM transcriptional activation system. a) The dCas9-SAM system is made up of a dCas9 fused to the transcriptional activator, VP64. The accompanying sgRNA can also be modified to contain two RNA aptamers for binding with MS2 coat proteins that are also fused to one p65 and one HSF1 transcription activator. Adapted from Figure 1f of La Russa et al. (2015). b) A comparison of the activation efficiency of dCas9-VP64 by itself (yellow) as well as with the modified sgRNA system (green) in the activation of four different genes: HBG1, IL-1B, IL1R2, and ZFP42. Relative expression levels were quantified using qPCR, with fold changes determined by comparing with GFP-transfected cells. Adapted from Figure 1b of Konermann et al. (2015). c) The dCas9-VPR system is composed of an ordered fusion of transcriptional activators VP64, p16, and RTA. This system does not require a specially modified sgRNA to achieve the same activation capability as the dCas9-SAM system. Adapted from Figure 1a of Chavez et al. (2016). d) A comparison of the activation performance of dCas9-VP64, dCas9-VPR, and dCas9-SAM of the RHOXF2 gene

   单独的dCas9与靶位点的结合在空间上可以干扰转录酶的结合，起到抑制靶向基因转录的作用，这一过程称为CRISPRi（或CRISPR干扰）。这个简单的CRISPRi系统可以高达1000倍抑制，有效敲低细胞中的基因表达。虽然这个系统在细菌、酵母和其他原核细胞中的表现相当好，但它在抑制哺乳动物细胞中的基因表达方面效果较差。

   因此我们开发了dCas9-KRAB系统，在这个系统中，dCas9与Kox1的转录阻遏物结构域KRAB（Krüppel-associated box）融合（图3a）。这种增强的CRISPRi系统依靠KRAB募集各种各样的组蛋白修饰因子，通过形成异染色质的方式可逆地抑制基因表达。该系统，在瞬时转染期间可以高度特异性地使内源性真核基因表达降低60-80％（图3b）。此外，在HeLa细胞中，稳定整合到基因启动子区域的dCas9-KRAB可以使内源性基因产生5-10倍的抑制作用，当靶位点位于转录起始位点下游50-100bp时可产生100倍的抑制效应。 dCas9-KRAB对细胞生长没有影响，使其成为无毒的基因沉默方法。

   不同于其他经典的基因沉默方法，如RNAi（一种通过降解细胞质中mRNA来敲低基因表达的方法），dCas9-KRAB系统在DNA水平上提供可抑制。这使得高度特异性抑制非编码RNA，miRNA，反义转录物和核定位的RNA成为可能。

Figure 3 ：The dCas9-KRAB transcriptional repression system. a) dCas9 can be fused to KRAB, a transcriptional repressor. Adapted from Shalem et al. (2015). b) A comparison of relative CD71 expression levels in a dCas9 (blue) vs. a dCas9-KRAB (red) system targeted to CD71 using three different sgRNAs. Relative expression levels were determined from flow cytometry for CD71 protein expression. Adapted from Figure 3c of Gilbert et al. (2013).

• 1 . CRISPR-Cas9系统
  • 1.1. CRISPR-Cas9组成
  • 1.2. 作用机制
  • 1.3. 不同的Cas9系统
  • 1.4. Cas9-基因敲除
  • 1.5. Cas9-敲入系统
• 2 . CRSPER- dCas9系统
  • 2.1. dCas9-转录调控系统
  • 2.2. dCas9-基因激活与抑制系统
  • 2.3. dcas9-表观遗传系统
• 3 . dCas9技术路线
  • 3.1. gRNA设计
  • 3.2. dCas9实验流程
  • 3.3. 实验问题与解决方案