CRISPR-dCas9-表观遗传调控系统

    表观遗传调节是往往是通过影响一段染色质的结构起作用，比如将染色质压缩成紧密状态（异染色质），使基因难以转录，或者使染色质打开以促进转录。表观遗传调节包括DNA甲基化、组蛋白甲基化、组蛋白乙酰化、组蛋白磷酸化等等。

    最近，人们将dCas9与表观遗传修饰酶融合在一起，形成dCas9表观遗传编辑系统，该系统成员如表1所示。

Table 1 - The dCas9 Epigenetics Toolbox

    组蛋白乙酰化是最强大的基因表达增强子系统之一。dCas9-p300的开发，使得人们能够直接改变靶标基因附近的染色质状态。在这个系统中，人类E1A相关蛋白p300的催化核心与dCas9融合，这是组蛋白乙酰化的关键成分（图4a）。当靶向编码区或启动子区时，这个系统可成功诱导基因高表达。特别是，当靶向启动子或增强子时，基因表达可增强50至10,000倍（图4b）。通过转录组分析评估得到，基因激活是高度特异性的。这表明该系统可以精确调控某段染色质的变化。

    dCas9-p300是一种简单而独特的工具，可用于研究调控元件和靶基因表达之间的复杂关系。

Figure 4 ：The dCas9-p300 system for epigenetic activation. a) dCas9 fused to the core catalytic domain of p300 can acetylate target sites in the genome. Acetylation of the target gene synergizes with the action of transcription factors and RNA Polymerase II, resulting in transcriptional upregulation. Adapted from Figure 1b of Zentner et al. (2015). b) Comparison of relative expression levels of IL1RN when dCas9 by itself vs. dCas9 fused to the p300 catalytic core is targeted to the IL1RN promoter. Relative expression levels determined by qRT-PCR. Adapted from Figure 1c of Hilton et al. (2015).

    dCas9-LSD1是dCas9-p300激活系统的互补基因抑制系统。在该系统中，dCas9与赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1（LSD1）融合（图5a）。 Kearns等人在稳定表达dCas9-LSD1的小鼠胚胎干细胞系中，设计Oct4基因的远端增强子区域的gRNA，Oct4基因被抑制（12）。然而，当dCas9-LSD1针对Oct4启动子时，没有观察到效果。这使得dCas9-LSD1成为研究增强子调控活性的工具。这与其他系统如dCas9-KRAB（它们是更全面的基因表达控制器）互补。当靶向上游增强子时，dCas9-LSD1也能够使下游基因表达沉默（图5b）（12），而不破坏基因组结构。

    由于在增强子区域内发现了与人类疾病相关的许多基因组区域，因此dCas9-LSD1以高度特异的方式功能性地靶向增强子元件的能力使其在定义增强子 - 基因关系方面具有无价之宝。当与增强子靶向的sgRNA池组合使用时，该系统可以提供高通量的方式来鉴定与基因相关的所有增强子。

Figure 5 ： The dCas9-LSD1 system for epigenetic repression. a) dCas9 fused to LSD1 can demethylate target sites in the genome. Demethylation of the target gene results in transcriptional downregulation. Adapted from Figure 1b of Zentner et al. (2015). b) The relative expression level of the TBX3 gene was assessed via quantitative PCR analysis when the sgRNA of the dCas9-LSD1 system was fused with a distal enhancer vs. a promoter. sgRNAs specific to an unrelated genomic region were used as controls. Adapted from Figure 1e of Kearns et al. (2015).

    哺乳动物细胞中的靶向DNA甲基化主要发生在CpG二核苷酸序列内胞嘧啶的第五个碳上。细胞发育，分化和肿瘤都可以通过DNA甲基化来调节，高甲基化与癌症和神经系统疾病密切相关。使DNA甲基化易于调节的技术可以直接探索甲基化状态和基因表达之间的功能关系，甚至可以开发治疗疾病的疗法。

    dCas9-Tet1-CD是以这种方式编辑表观基因组的新技术之一。该系统由与Tet1（十 - 十一易位甲基胞嘧啶双加氧酶1）的催化结构域（CD）融合dCas9组成，该酶触发DNA去甲基化（图6a）。伴随的sgRNA也可以进行修饰，使之包含一个MS2二聚体，每个二聚体再与两个Tet1-CD模块融合。有研究表明，该系统转染后4天后观察到基因的激活（图6b）。在不同的人和小鼠细胞系中，结合精确的sgRNA设计和控制该系统不同组分的比例，dCas9-Tet1-CD系统及其伴随的MS2-Tet1-CD系统能够在特定位置有效去甲基化，且具有很小的脱靶效应。

dCas9-Tet1-CD系统地靶向特异性将帮助科学家轻易地探索特定基因启动子靶点甲基化对下游基因的影响。最近，dCas9-Tet1-CD系统结合常规sgRNA也被用于靶向BRCA1启动子的表观遗传修饰，BRCA1是一种肿瘤抑制基因，其过度甲基化沉默与非家族性乳腺癌和卵巢癌相关。这样的系统也可以用来恢复其他肿瘤抑制基因的功能活性。

Figure 6 ： The dCas9-TET1-CD system for targeted DNA demethylation. a) dCas9 is fused to the catalytic domain of TET1 (TET1-CD). The accompanying sgRNA is additionally modified to contain two RNA aptamers that recruit MS2 coat proteins, each fused to a TET1-CD. Adapted from Figure 1a of Xu et al. (2016). b) qRT-PCR was used to assess mRNA levels of RANKL gene expression using two sgRNAs designed to target the RANKL promoter region (-800 bp upstream of transcription start site). Adapted from Figure 2c of Xu et al. (2016).

    与基于组蛋白的细胞表型控制不同，DNA甲基化对基因表达的作用更稳定和长期。基于dCas9的甲基化系统不仅具有跨物种能力，而且对CpG甲基化不敏感。

    dCas9-DNMT3A是先前讨论的dCas9-Tet1-CD系统的甲基化对应物。由Vojta等开发，该系统是dCas9（通过灵活的Gly4Ser接头）与DNMT3A的催化结构域（一种能够在体内甲基化CpG位点的活性DNA甲基转移酶）融合。这个dCas9-DNMT3A系统在HEK293细胞中成功地诱导BACH2启动子上游和下游的位点特异性CpG甲基化，最高浓度的甲基化活性（60％）位于PAM序列下游27bp处。当针对IL6ST启动子时，转染后10天后两种基因的表达水平均显着降低。此外，通过dCas9-DNMT3A与sgRNA池结合同时靶向多个基因特异性位点导致甲基化的协同作用，将甲基化提高2倍，扩大该系统的基因沉默能力。

    自其发展以来，dCas9-DMNT3A也被用于多种癌症相关的肿瘤抑制基因的启动子的甲基化如（CDKN1A和2A启动子甲基化）。该项研究表明，CDKN1A启动子的甲基化导致CDKN1A的表达下降和细胞增殖能力的增加，进一步证明了该系统用于功能基因组学研究。

Figure 7 ：The dCas9-DNMT3A system for targeted DNA methylation. a) dCas9 is fused to the catalytic domain of DNMT3A. In vivo, DNMT3A recruits a partner for dimerization along with DNMT3L proteins (shown in dashed red box and ovals, respectively). Adapted from Figure 1a of Vojta et al. (2016). b) RT-qPCR analysis of IL6ST gene expression via dCas9-fused to active DMNT3A. Expression levels induced by dCas9 fused to inactive DMNT3A along with dCas9 accompanied by non-targeting sgRNAs were measured as negative controls. Fold change is relative to mock-transfected cells. Adapted from Figure 4a of Vojta et al. (2016).

• 1 . CRISPR-Cas9系统
  • 1.1. CRISPR-Cas9组成
  • 1.2. 作用机制
  • 1.3. 不同的Cas9系统
  • 1.4. Cas9-基因敲除
  • 1.5. Cas9-敲入系统
• 2 . CRSPER- dCas9系统
  • 2.1. dCas9-转录调控系统
  • 2.2. dCas9-基因激活与抑制系统
  • 2.3. dcas9-表观遗传系统
• 3 . dCas9技术路线
  • 3.1. gRNA设计
  • 3.2. dCas9实验流程
  • 3.3. 实验问题与解决方案