gDNA设计

       CRISPR Cas9系统只需设计一个包含20个碱基对的RNA寡核苷酸，即可靶向任何基因组位点。gRNA是CRISPR Cas9系统的重要组成部分，在设计gRNA序列时需要考虑诸多因素。

    在细菌和古细菌中，CRISPR RNA（crRNA）和反式激活CRISPR RNA（tracrRNA）形成一个复合体，作为引导Cas9核酸酶降解外来遗传物质的引导装置。 我们将tracrRNA和crRNA结合成一个单一的合成的gRNA，这个单组分系统不仅简化了实验设计，而且还产生了相同或更高的导向效率（图1）。最常用的gRNA长约100个碱基对。 通过gRNA的5'端的特异性的20个碱基对（蓝色区域），CRISPR Cas9系统可以靶向与该序列互补的任何基因组区域。

Figure 1 ：An example of the crRNA-tracrRNA complex and a gRNA

       CRISPR Cas9系统的靶向特异性由gRNA 5'末端的20个核苷酸序列决定。 对于化脓性链球菌CRISPRCas9系统，所需的靶序列必须紧接在5'-NGG PAM基序（间隔子相邻基序）之前，因此设计的序列为“20N+NGG3”。 gRNA通过互补碱基配对将Cas9核酸酶引导至靶序列，并且Cas9核酸酶使PAM序列上游〜3个核苷酸处双链DNA断裂（图2）

Figure 2： For the S. pyogenes system, the target sequence must be immediately adjacent to a 5’-NGG PAM sequence. The gRNA will form complementary base paring with the opposite strand of the target sequence and mediate a double strand break ~3bp upstream of the PAM sequence through the Cas9 nuclease.

      由于一些启动子可以限制靶点选择和gRNA设计，因此选择合适的启动子驱动gRNA表达是必要的。 例如，依赖于RNA聚合酶III的U6启动子或T7启动子分别在RNA序列的5'端需要G或GG来启动转录。 因此，如果U6或T7启动子用于酿脓链球菌CRISPR系统中，那么靶序列分别限于下列形式：GN16-19NGG或GGN15-18NGG。 然而，通过将额外的G或GG添加到20个碱基对序列的5'末端（图3），可以绕过这个限制。

Figure 3 – Sequence restrictions imposed by the use of U6 or T7 RNA polymerase III promoters for gRNA expression can be by passed as illustrated here.

✩在设计gRNA的20个碱基对的引导序列时，应考虑以下三点：

       1）GC含量：典型的范围在GC含量为40％-80％之间，其中GC含量较高的RNA更容易造成脱靶; 

       2）长度：长度可以调节，范围从17-24碱基对，较短的序列导致最小的脱靶效应；

       3）避免gRNA的潜在脱靶位点。

✩gRNA与靶位点之间的错配耐受性可导致CRISPR Cas9系统的脱靶效应，并且通常其发生取决于以下因素：

       ①.脱靶效应与gRNA的序列，其中一些gRNA对错配的耐受性比其它gRNA更小。

       ②.引入细胞的Cas9和gRNA之间的比例和比率也影响脱靶效应，小心地滴定Cas9和gRNA可以降低这些效应。

       ③. 通过非同源末端连接（NHEJ）途径进行基因沉默时，靶点需更接近于蛋白质编码区的N'端以产生最大的基因破坏。

       ④.基因组DNA的编码链和非编码链都可以被靶向，因为它们在产生突变方面同样有效。

       ⑤如果基因组编辑需要同源性定向修复（HDR），则目标位点的选择受到期望的插入位置的限制。

       在设计gRNA时，需要认真考虑上面列出的各种要求。精心设计的gRNA将会产生更高的编辑效率和最小化脱靶效应。

       当使用成对的Cas9切口酶诱导的双链断裂时需要进一步考虑。注意以下几点很重要（图4）：

       ⅰ.理想情况下，切割时需要产生5'悬垂链。

       ⅱ.两个gRNA之间的距离不超过20个碱基。

       ⅲ.两个gRNA需要在相反链上设计靶序列。 请注意，PAM序列需要在目标序列的上游。

       在设计了两种gRNA之后，它们可以以1：1的比例混合，并与Cas9 Nickase一起转染的细胞中。

Figure 4 ：When using paired Cas9 nickases additional considerations need to be given to the gRNA design. These include producing a 5’ overhang, the spacing between the two gRNAs, and the relative position of the two gRNA target sites.

       有许多工具可以帮助我们设计gRNA的过程。在这里，我们将重点介绍两个这样的工具：Chop Chop Harvard和CRISPR Design。

♫.Chop Chop Harvard

       将一段感兴趣基因序列或登录号码输入到Chop Harop Harvard（图5），软件分析序列并鉴定紧接着PAM序列（5'-NGG）的所有可能的20bp序列。然后根据预先设定的代码对GC进行评分，该代码查看GC含量和潜在脱靶位点，并将它们从最佳得分排列到最低得分。有关特定gRNA的更多信息，只需在gRNA序列上单击即可。这将打开显示该特定gRNA的潜在脱靶位点的页面，甚至提供可用于通过SURVEYOR测定来筛选这些脱靶位点潜在突变的引物序列。

Figure 5 ：The Chop Chop Harvard results page highlighting the ranking, exon position, and potential off target site counts.

♫.CRISPR Design

       使用CRISPR Design的主要优势在于能够提供所有潜在gRNA的脱靶目标的详细信息。 它使每一个gRNA序列都发生了突变，并提供了关于其脱靶位置和与设计的gRNA错配数目的详细报告。 当设计两个gRNAs用于配对的内切酶活性时，该软件也是优越的，因为它会自动发现两个彼此靠近的gRNA。

       然而，这个软件的主要缺点是它一次只能分析500个碱基对的序列。 因此，我们建议使用Chop Chop Harvard选择潜在的gRNA序列，然后推荐进一步的分析用CRISPR Design工具。

• 1 . CRISPR-Cas9系统
  • 1.1. CRISPR-Cas9组成
  • 1.2. 作用机制
  • 1.3. 不同的Cas9系统
  • 1.4. Cas9-基因敲除
  • 1.5. Cas9-敲入系统
• 2 . CRSPER- dCas9系统
  • 2.1. dCas9-转录调控系统
  • 2.2. dCas9-基因激活与抑制系统
  • 2.3. dcas9-表观遗传系统
• 3 . dCas9技术路线
  • 3.1. gRNA设计
  • 3.2. dCas9实验流程
  • 3.3. 实验问题与解决方案