组蛋白乙酰化研究案例（一）

（一）调控通路：

（二）实验流程：

作者首先用Q-PCR检测临床样本神经胶质瘤/癌旁组织细胞的LncRNA表达，然后分析LncRNA CRNDE转录本。作者从功能和机制两方面研究LncRNA CRNDE。（1）LncRNA CRNDE的功能是促进癌细胞生长：通过建立CRNDE过表达/敲低稳定株进行CCK8实验、划痕实验、Transwell、小鼠体成瘤实验检测CRNDE功能。（2）调控机制研究：首先用WB方法检测正常细胞和胶质瘤细胞的mTOR通路相关蛋白的表达，然后用P300/CBP抑制剂处理细胞作为对照，WB检测CRNDE敲低后的P70S6K的磷酸化说明CRNDE促进P70S6K的磷酸化。之后，作者用CHIP实验检测CRNDE启动子与组蛋白成分以及P300/CBP的结合情况来说明P300/CBP结合到启动子上促进组蛋白乙酰化，最后通过检测P300/CBP敲低后CRNDE的表达说明P300/CBP促进CRNDE的表达。

（三）核心FIGURE:

Figure1说明的是LncRNA CRNDE的启动子被p300乙酰化。

A、 CHIP实验，用P300抗体从癌细胞U87MG和非癌细胞NHA钓取与P300结合的DNA片段，Q-PCR检测表明LncRNA CRNDE启动子与P300结合在癌细胞中比非癌细胞明显增多。

B、 ChIP实验，分别用甲基化和乙酰化蛋白抗体钓取DNA片段，结果表明癌细胞的LncRNA CRNDE启动子乙酰化增加。

C、 Q-PCR检测细胞中LncRNA CRNDE的表达，si-P300的细胞LncRNA表达量明显下降。

Figure2说明的是LncRNA CRNDE通过P70S6的磷酸化激活mTOR信号通路调控肿瘤基因相关基因和抑癌因子的表达

A、 Western Blot检测癌细胞和非癌细胞中P70S6和其磷酸化情况。

B、 用Western Blot检测受mTOR抑制剂处理后的P70S6的磷酸化，然后用Q-PCR检测c-myc、cyclinD1、p53、PTEN基因的表达，结果是mTOR抑制后P70S6磷酸化下降，癌细胞增殖相关基因c-myc、cyclinD1表达下降，抑癌因子表达升高。

C、 用Western Blot检测sh-CRNDE的P70S6的磷酸化，然后用Q-PCR检测c-myc、cyclinD1、p53、PTEN基因的表达，结果与使用mTOR抑制剂处理一致。

本公司可提供的技术服务项目

本公司可进行以上类似实验的实验设计及整体实验外包项目，包括CHIP、慢病毒稳转株的建立（过表达/敲低）、q-pcr、WB，其中CHIP为本公司主营项目。

一、CHIP技术：主要研究蛋白与基因启动子之间的关系

本实验分别用P300和PolII抗体从癌细胞U87MG和非癌细胞NHA钓取与P300、PolII结合的DNA片段，q-pcr检测表明癌细胞的LncRNA CRNDE启动子与P300结合与非癌细胞相比明显增多。

参考文献：Yunliang Wang, Yutong Wang,Jinfeng Li，et al. CRNDE, a long-noncoding RNA, promotes glioma cell growth and invasion through mTOR signaling［J］.Canlet.2015,03,027