组蛋白乙酰化研究案例（二）

（一）调控通路：

胞外因子CCL21通过激活RhoC/CIT通路促进GLI2的磷酸化进入细胞核，磷酸化的GLI2进入细胞核后与LncBCAR4结合一起将SNIP1/P300、PNUTS-Pp1结合到靶标基因的启动子上,诱导启动子组蛋白乙酰化，促进靶标基因表达。

（二）实验流程：

（三）核心FIGURE：

Figure1说明的是CCL21诱导GLI2的磷酸化使其与LncBCAR4结合，促进LncBCAR4与SNIP1、PNUTS结合从而促进靶标基因的表达。

A、 RNA pull-down，用LncBCAR4探针从MDA-MB-231中钓取与之结合的蛋白，进行WB检测，结果表明LncBCAR4结合蛋白GLI2、SNIP1和PNUTS。

B、 使用CCL21等处理细胞后用WB检测GLI2的磷酸化情况，表明CCL21能促进GLI2的磷酸化。

C、 通过分别敲低CTL和CIT之后检测经CCL21处理的GLI2，结果表明CCL21不影响GLI2的表达而是影响其磷酸化水平。

D、  用CCL21处理不同时间后检测细胞质和细胞核的GLI2磷酸化情况。

Figure2说明的是LncBCAR4将SNIP1和PNUTS结合到靶标基因启动子上促进组蛋白的乙酰化。

A、 CHIP，分别用GLI1和p-GLI2抗体钓取DNA片段，表明CCL21处理后靶标基因启动子上结合的GLI2和p-GLI2上升。

B、 CHIRP，用LncBCAR4探针钓取与之结合的DNA片段进行qPCR检测，结果表明经CCL21处理后靶标基因启动子上结合的LncBCAR4增加。

C、 RNA pull-down，用LncBCAR4探针钓取与RNA结合的蛋白，检测SNIP1、PNUTS与LncBCAR4结合的区域，

D、  EMSA检测LncRNA与SNIP1、PNUTS的结合。

E、 RIP，反向验证SNIP1、PNUTS与LncBCAR4结合的区域。

F、 CHIP，靶基因启动子乙酰化的组蛋白，表明CCL21处理后组蛋白乙酰化增加。

G、  用qRT-PCR检测LncBCAR4敲低后的靶标基因的表达情况,结果表明BCAR4敲低后靶标基因的表达量下降。

本公司可提供的技术服务项目

本公司可进行类似实验的实验设计及整体实验外包项目，包括RNA pull-down、WB、慢病毒稳转株的建立（过表达/敲低）、CHIP、RIP、q-pcr，其中RNA pull-down、CHIP、RIP为本公司主营项目。

一、RNA pull-down：是检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间的相互作用，主要研究lncRNA与蛋白的相互作用。

用LncBCAR4探针钓取与RNA结合的蛋白，然后用目的蛋白抗体对产物进行WB检测，表明LncRNA BCAR4与CIT、GL12、SNIP1以及PNUTS都能特异性的结合。我公司在实验体系中同时提供lncRNA正义链与反义链的pull down。

二、CHIP技术：主要研究蛋白与基因启动子之间的关系

    例一：

本实验GLI2和磷酸化的GLI2抗体进行CHIP从不同细胞中获取与蛋白结合的DNA片段，然后进行Q-PCR验证，实验结果表明经CCL21处理后的细胞靶标基因启动子上结合的GLI2和p-GLI2上升。

       例二：

本实验用乙酰化的组蛋白抗体钓取与之结合的DNA片段，然后进行Q-PCR检测目的基因启动子，结果表明，经CCL21处理后启动子上的组蛋白乙酰化明显增加。

三、RIP技术：主要研究蛋白与RNA的相互作用

本实验为了验证LncRNA与SNIP1结合位点，对LncRNA进行相应位点的突变后，用Myc标签抗体钓取与带标签的SNIP1蛋白结合的RNA，然后进行QRT-PCR检测CHIP产物中的RNA，实验结果表明与SNIP1蛋白结合的LncRNA结合位点在97-274区间。

 参考文献：Zhen Xing , Aifu Lin , Chunlai Li，et al. LncRNA Directs Cooperative Epigenetic Regulation Downstream of Chemokine Signals［J］. Cell. 2014, 159(5): 1110–1125.