CCAT2, a novel noncoding RNA mapping to 8q24,underlies metastatic progression and chromosomal instability in colon cancer

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转录因子相关调控研究案例(一)

一、调控通路


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LncRNA CCAT2rs69x3267snp基因转录产生,CCAT2的表达结合转录因子TCF7L2并将其结合到靶标基因启动子上促进基因转录为RNA,这些靶标基因编码与细胞增殖相关的蛋白,同时转录的RNA经剪切加工后可产生miR-17-5p


二、实验流程

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作者首先用Q-PCR检测结肠癌病人本中结肠胞和癌旁组织细胞的LncRNA表达,表明LncRNA CCAT2在结肠胞中高表达,然后用原位验证LncRNA在结肠胞中的高表达从而确定了本文的主角LncRNA CCAT2。随后作者CCAT2分别行功能研究和作用机制研究。(1)功能研究:作者建立CCAT2的表达胞株行小鼠体内成瘤试验胞迁移试验建立CCAT2敲低定株胞侵袭实验和基因不定性检测说CCAT2对肿胞增殖的作用。(2)机制研究:机制研究可分两个方面,一是在大的方向上CCAT2促MYC和miR-17-5p的表达,二是CCAT2通招募转录因子MYC和miR-17-5p表达。作者首先用Q-PCR和WB检测CCAT2表达/敲低胞的MYC的表达CCAT促MYC基因转录为mRNA,用q-pcr检测CCAT2表达后microRNA的表达CCAT2促miR-17-5p的表达,通添加microRNA的反向互序列检测细胞的迁移,miR-17-5a促进细迁移。作者用Q-PCR检测细胞核分离后的CCAT2表明CCAT2在胞核内,随后通CHIP和RIP实验验证CCAT2和转录因子TCF7L2与Myc启合,然后用FISH检测CCAT2表达胞的MYC表达等一系列实验说CCAT2通招募转录因子激活基因转录蛋白表达。最后作者检测CCAT2表达后的CD44和vim mRNACCAT2促进这两种基因转录


三、核心FIGURE

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FIGURE1说明的是LncRNA CCAT2促进MYC、miR-17-5p、miR-20a的表达,促进细胞增殖转移。

A、     分别用WB和Q-PCR检测CCAT2过表达后的MYC表达,表明CCAT2过表达促使MYC表达升高。

B、     Q-pcr检测CCAT2过表达后的microRNA的表达,结果表明CCAT2过表达使miR-17-5p和miR-20a表达升高,miR-146a表达下降。

C、     别用WB和Q-PCR检测CCAT2敲低后的MYC表达,表明CCAT2敲低促使MYC表达下降。

D、     通过添加microRNA的反向互补序列检测细胞的迁移,表明miR-17-5a和miR-20a的互补序列使细胞迁移能力下降。说明miR-17-5a和miR-20a促进细胞迁移。

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     Figure2说明的是CCAT2结合转录因子TCF7L2到MYC等基因启动子上促进表达。

A、     核质分离后,q-pcr检测CCAT2,表明CCRT2在细胞核内。

B、     CHIP实验,用转录因子蛋白TCF7L2抗体钓取与之结合的DNA片段,然后进行q-pcr检测,表明TCF7L2与MYC启动子结合。

C、     RIP实验,用转录因子蛋白TCF7L2抗体钓取与之结合的RNA片段,然后进行q-pcr检测,表明TCF7L2与lncRNA CCAT2结合。

D、     蛋白FISH,用荧光免疫原位杂交检测CCAT2过表达细胞的波形蛋白,表明CCAT2过表达细胞的波形蛋白信号很强。

E、     Q-PCR检测CCAT2过表达后的CD44和波形蛋白mRNA的表达。

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本公司可提供的技术服务

本公司可进行以上类似实验的实验设计及整体实验外包项目,包括Q-PCR、Western Blot、CHIP实验、慢病毒稳转株的建立(过表达/敲低)、RIP实验等,其中的CHIP实验、RIP、蛋白FISH为本公司主营项目。


一、 CHIP实验:主要研究蛋白与基因启动子之间的关系。


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本实验作者用转录因子蛋白TCF7L2抗体钓取与蛋白结合的DNA片段,然后用Q-PCR检测CHIP产物是否含有MYC启动子序列,说明了TCF7L2与MYC启动子结合。我公司在实验体系中设置阳性及阴性对照,进一步排除系统误差。


二、RIP实验,主要研究蛋白与RNA的相互作用。

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本实验作者用转录因子蛋白TCF7L2抗体钓取与蛋白结合的RNA片段,然后用Q-PCR检测RIP产物,说明了TCF7L2与LncRNA CCAT2结合。我公司在实验体系中设置阳性及阴性对照,进一步排除系统误差。


   三、蛋白FISH,即蛋白免疫荧光原位杂交:细胞内蛋白的定性、定位和定量。

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本实验作者用荧光免疫原位杂交检测CCAT2过表达细胞的波形蛋白,表明CCAT2过表达细胞的波形蛋白信号很强,说明CCAT2过表达促进波形蛋白表达。我公司在实验体系中设置阴性和阳性对照。

 

参考文献:Hui Ling,Riccardo Spizzo,Yaser Atlasi,et al. CCAT2, a novel noncoding RNA mapping to 8q24,underlies metastatic progression and chromosomal instability in colon cancer[J]. Genome Research, 2013,23:1446–1461

 






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