转录因子相关调控研究案例（一）

一、调控通路

LncRNA CCAT2由rs69x3267snp基因转录产生，CCAT2的表达结合转录因子TCF7L2并将其结合到靶标基因启动子上促进基因转录为RNA，这些靶标基因编码与细胞增殖相关的蛋白，同时转录的RNA经剪切加工后可产生miR-17-5p。

二、实验流程

作者首先用Q-PCR检测结肠癌病人样本中结肠癌细胞和癌旁组织细胞的LncRNA表达，表明LncRNA CCAT2在结肠癌细胞中高表达，然后用原位杂交验证LncRNA在结肠癌细胞中的高表达从而确定了本文的主角LncRNA CCAT2。随后作者对CCAT2分别进行功能研究和作用机制研究。（1）功能研究：作者建立CCAT2的过表达稳定细胞株进行小鼠体内成瘤试验和细胞迁移试验，建立CCAT2敲低稳定株进行细胞侵袭实验和基因不稳定性检测说明CCAT2对肿瘤细胞增殖的作用。（2）机制研究：机制研究可分为两个方面，一是在较大的方向上说明CCAT2促进MYC和miR-17-5p的表达，二是说明CCAT2通过招募转录因子促进MYC和miR-17-5p表达。作者首先用Q-PCR和WB检测CCAT2过表达/敲低细胞的MYC的表达说明CCAT促进MYC基因转录为mRNA，用q-pcr检测CCAT2过表达后microRNA的表达说明CCAT2促进miR-17-5p的表达，通过添加microRNA的反向互补序列检测细胞的迁移，说明miR-17-5a促进细胞迁移。作者用Q-PCR检测细胞核质分离后的CCAT2表明CCAT2在细胞核内，随后通过CHIP和RIP实验验证CCAT2和转录因子TCF7L2与Myc启动子结合，然后用FISH检测CCAT2过表达细胞的MYC表达等一系列实验说明CCAT2通过招募转录因子激活基因转录促进蛋白表达。最后作者检测CCAT2过表达后的CD44和vim mRNA说明CCAT2促进这两种基因转录。

三、核心FIGURE

FIGURE1说明的是LncRNA CCAT2促进MYC、miR-17-5p、miR-20a的表达，促进细胞增殖转移。

A、     分别用WB和Q-PCR检测CCAT2过表达后的MYC表达，表明CCAT2过表达促使MYC表达升高。

B、     Q-pcr检测CCAT2过表达后的microRNA的表达，结果表明CCAT2过表达使miR-17-5p和miR-20a表达升高，miR-146a表达下降。

C、     别用WB和Q-PCR检测CCAT2敲低后的MYC表达，表明CCAT2敲低促使MYC表达下降。

D、     通过添加microRNA的反向互补序列检测细胞的迁移，表明miR-17-5a和miR-20a的互补序列使细胞迁移能力下降。说明miR-17-5a和miR-20a促进细胞迁移。

     Figure2说明的是CCAT2结合转录因子TCF7L2到MYC等基因启动子上促进表达。

A、     核质分离后，q-pcr检测CCAT2，表明CCRT2在细胞核内。

B、     CHIP实验，用转录因子蛋白TCF7L2抗体钓取与之结合的DNA片段，然后进行q-pcr检测，表明TCF7L2与MYC启动子结合。

C、     RIP实验，用转录因子蛋白TCF7L2抗体钓取与之结合的RNA片段，然后进行q-pcr检测，表明TCF7L2与lncRNA CCAT2结合。

D、     蛋白FISH，用荧光免疫原位杂交检测CCAT2过表达细胞的波形蛋白，表明CCAT2过表达细胞的波形蛋白信号很强。

E、     Q-PCR检测CCAT2过表达后的CD44和波形蛋白mRNA的表达。

本公司可提供的技术服务

本公司可进行以上类似实验的实验设计及整体实验外包项目，包括Q-PCR、Western Blot、CHIP实验、慢病毒稳转株的建立（过表达/敲低）、RIP实验等，其中的CHIP实验、RIP、蛋白FISH为本公司主营项目。

一、 CHIP实验：主要研究蛋白与基因启动子之间的关系。

本实验作者用转录因子蛋白TCF7L2抗体钓取与蛋白结合的DNA片段，然后用Q-PCR检测CHIP产物是否含有MYC启动子序列，说明了TCF7L2与MYC启动子结合。我公司在实验体系中设置阳性及阴性对照，进一步排除系统误差。

二、RIP实验，主要研究蛋白与RNA的相互作用。

本实验作者用转录因子蛋白TCF7L2抗体钓取与蛋白结合的RNA片段，然后用Q-PCR检测RIP产物,说明了TCF7L2与LncRNA CCAT2结合。我公司在实验体系中设置阳性及阴性对照，进一步排除系统误差。

   三、蛋白FISH，即蛋白免疫荧光原位杂交：细胞内蛋白的定性、定位和定量。

本实验作者用荧光免疫原位杂交检测CCAT2过表达细胞的波形蛋白，表明CCAT2过表达细胞的波形蛋白信号很强，说明CCAT2过表达促进波形蛋白表达。我公司在实验体系中设置阴性和阳性对照。

参考文献：Hui Ling,Riccardo Spizzo,Yaser Atlasi,et al. CCAT2, a novel noncoding RNA mapping to 8q24,underlies metastatic progression and chromosomal instability in colon cancer［J］. Genome Research, 2013,23:1446–1461