Mapping the Global Chromatin Connectivity Network for SOX2 Function in Neural Stem Cell Maintenance

作者为了确定神经干细胞中SOX2对转录的调控作用，  分析了不同品牌的RNA聚合酶Ⅱ（pol II）抗体在野生型小鼠NSC（wTR1、wTR2 、wTR3）和SOX2敲除小鼠NSC（mTR1、mTR2、mTR3）中所产生的ChIA-PET数据结果，鉴定了RNA pol II在启动子结合位点和远程互作位点（图1b）。统计分析发现，在SOX2敲除组（mut）中，无论是启动子结合位点还是远程互作位点都比野生组（wt）少（图1b）。同时，ChIA-PET结果显示在敲除SOX2后，多个基因的启动子的远程互作减少（图1C-G）。这些数据表明，SOX2主要通过调控基因启动子的远程互作来调控基因表达。

为了进一步确定SOX2对转录的调控作用，根据SOX2-ChIP-seq结果把结合位点分为TSS结合点与远程结合点，并分别于H3K27ac+和H3K4me1+的ChIP-seq结果进行比较（图2a，2b）。H3K27ac+是转录激活的标志蛋白，主要标示启动子与增强子的位置。H3K4me1+也是转录激活标志蛋白，主要标示增强子位置。结果发现SOX2的结合位点主要在远程增强子的位置。（图2b）。然后作者把远程互作模式分为三类：启动子与远程启动子区域互作模式（P-P）、启动子与远程区域互作模式（P-e）、非启动子间互作模式，比较发现pol II介导的远程结合模式主要以p-p或p-e为主，约占90%（图2c）。然后联合SOX2-ChIP-seq结果发现SOX2的结合位点主要在p-e模式中（图2d）。最后， SOX2的ChIP-seq数据，以及H3K27ac、H3K4me1的ChIP-seq，3种不同品牌的RNA聚合酶Ⅱ（pol II）抗体的ChIA-PET结果联合分析，显示SOX2的结合位点主要在远程增强子区域。

在野生型小鼠NSC和SOX2敲除小鼠中，联合pol II的ChIA-PET结果与SOX-2-ChIP-seq结果分析SOX2对下游靶基因的调控模式，结果显示，SOX2在靶基因的远程区域有许多结合位点，SOX2的敲除对靶基因的远程互作有明显的抑制作用。因此SOX2主要通过调控基因远程结合区域来调控基因表达。

作者为了确定这些远程结合位点是否具有增强子的作用，将SOX2远程结合位点（即远程增强子（DA））构建到荧光载体的启动子前，并把这些荧光载体导入斑马鱼神经干细胞中，验证SOX2的结合位点是否是增强子（图4）。结果SOX2远程结合区域均能检测到绿色荧光信号，这说明这样远程的结合位点具有增强子的作用。

对NSC细胞内整体的RNA转录水平进行RNA-seq分析发现，敲除SOX2后，细胞整体RNA转录水平和具有远程协作调控的相关RNA转录水平下降（图5a）。当基因启动子与越多的增强子有互作时，基因的表达量越高（图5b）。接下来作者比较wt（野生型小鼠）与mut（SOX2敲除型小鼠）神经干细胞之间的基因表达差异，发现大多数基因在wt组中的表达比mut中的高（图5c）。SOX2敲除，总体基因表达水平下降。然后对这些基因根据结合模式进行分组比较表达差异（图5d），结果显示差异表达基因主要是以P-E模式（启动子与远程增强子互作模式）互作。综上所述，在NSC中，SOX2通过远程互作模式对转录水平进行调控。

SOCS3基因一种JAK/STAT信号传导抑制因子，它能抵抗NSC早熟分化为星形胶质细胞，同时也是SOX2的一个靶基因。RNA pol II的ChIA-PET结果与SOX2-ChIP-seq结果联合分析显示，SOX2在SOCS3基因的启动子及远程互作区域有集合位点，SOX2通过远程互作调控SOCS3基因的表达（图6a）。作者在SOX2敲除的神经干细胞中过表达SOCS3，细胞的生长能力得到恢复（图6b、6c）。

    综上所述，SOX2主要通过介导染色质远程增强子与靶基因启动子相互作用，对靶基因转录水平进行调控。