ChIP实验技术流程

日期：2014-12-12 标签：ChIP实验技术流程

一．实验前准备

1.实验设计与分组

2.实验试剂、耗材、仪器准备

3.试剂盒：Pierce™ Agarose ChIP Kit

二．实验开展（以哺乳动物贴壁细胞为例）

        A．交联与细胞裂解

1.用15cm培养皿培养细胞，细胞量达80%-90%，细胞数量约为1x10⁷ 个，待用。

以下步骤基于1次ChIP试验

2.交联：向每个含有培养液的培养皿中，加入16%的甲醛，使甲醛终浓度为1%.  轻轻晃动培养皿, 使混匀, 室温孵育10min.（交联时间很重要，过长影响ChIP结果，过短交联不完全，产生假阳性）

3.终止交联：向上述培养皿中，加入10X的甘氨酸溶液使其终浓度为1X的。混匀，室温孵育5min。

4.吸出培养皿中含有甲醛-甘氨酸的混合培养基。用1倍体积预冷的PBS清洗细胞两次。

5.在1ml预冷的PBS加10μl的Halt Cocktail。然后将此混合液加入清洗后细胞中，再用细胞刮搜集细胞，将细胞悬浮液用移液器转移到1.5m的微管离心管中。

6.将搜集的细胞于3000g离心5min。除去PBS，将细胞沉淀物保存在-80°，或者直接进行一下步骤：酶解

        B．酶解断裂染色质

1.准备好上述交联好的细胞。如果是冻存的，需在冰上解冻。

2.加100μl含蛋白酶抑制剂的Lysis Buffer 1至细胞沉淀物中吹打混匀，涡漩离心管15s，置于冰上孵育10min；9000g离心3min，弃除上清。

3.加0.25μl的Micrococcal Nuclease (ChIP 级) (10 U/μL)，涡漩离心管，在37°水浴锅温浴15min，每5min 颠倒混匀；

4.加10μl的MNase stop 溶液终止反应，短暂涡漩混匀，冰上孵育5min。

5.9000g离心5min，去上清，重新获得核酸复合物。

6.用50μl的含（蛋白酶/磷酸蛋白酶）抑制剂的Lysis Buffer 2重悬核酸复合物，置于冰上15min，每5min涡旋15s。

7.9000g离心5min。将酶解后含有染色质的上清液转移到一个新的1.5ml的离心管中。继续IP实验或者将样本储存在-80°。

        C．免疫沉淀蛋白-DNA复合物

1.取5μl上述50μl酶解后含有染色质片段上清液置于1.5ml 离心管，-20°保存

2.向剩余的45μl的上清液中加入450μl 1X IP Dilution buffer.

3.加入一抗及500μl的稀释裂解液到Plugged spin colum。并置于摇晃平台上，4°孵育过夜。抗体加入量如下：

    阳性对照组：加10ul Anti-RNA聚合酶II抗体

    阴性对照组：加1-2μl的正常的兔IgG

    实验待测样本组：特异性抗体浓度为1-10μg/IP反应

    摇床孵育2h。

4.吸取20μl的ChIP 级的含琼脂糖Protein A/G均一悬液（涡旋混匀）加到每个置于摇晃平台上的IP反应管中，4°孵育1h. 孵育后，除去下面底塞，将柱子放置于2ml的收集管中。3000g 离心30s，弃去废液。

5.塞入柱子底塞，加入0.5ml 的IP wash buffer 1 ,置于摇晃平板上，盖上盖子4°孵育5min。 除去底塞，将柱子置于新的收集管中；3000g离心30s。

6.重复步骤5两次，用IP Wash Buffer 2

7.重复步骤5一次，用IP wash buffer 3

8.除去残留的wash buffer 将柱子置于收集管中，3000g离心1min。

        D．65℃解交联蛋白质和DNA复合物

1.重新塞底塞，加入150μl的1X IP Elution buffer 到洗涤后的柱中，盖上盖子，恒温孵育器65°孵育30min （摇晃）。如果没有恒温摇床，则可置于65°加热板40min。每隔10min 重悬。

2.在洗脱过程中，准备含6μl 5M Nacl  和2μl 20mg/ml Proteinase K /IP 反应的 1.5ml的离心管。

3.溶解10% total input sample 样 加入150μl IP Elution buffer 、6μl 5M Nacl 和2μl 20mg/ml proteinase K ，置于室温

4.步骤1中65°温育，从加热块中移除柱子，打开盖子和底塞，将柱子置于1.5ml 含Nacl 和蛋白酶K的预收集管，盖上盖子，6000g离心1min

5.弃去柱子，盖上1.5ml 离心管，漩涡所有的IP和  total-input  样本置于65°加热块中1.5h。

        E．消化蛋白，纯化富集的DNA

1.每个IP  和total input sample，加750μl的DNA binding buffer；

2.吸取500μl/样本  到DNA Clean-Up 柱子上置于2ml 收集管中，10000g离心1min,弃去滤液；

3.吸取残留的sample 到同样的DNA clean-up 柱子，10000g离心1min，弃去滤液；

4.将上述柱子置于收集管中，加入750μl的DNA Column Wash buffer。10000g离心1min弃滤液；

5.将柱子置于空的收集管中，10000g离心2min；

6.将柱子置于新的1.5ml离心管中，吸取50μl的DNA Column Elution1. Solution 直接加入到柱子中央；

7.10000g离心1min，弃柱子，得到的溶液为纯化的DNA，可进行实时荧光定量PCR检测