外泌体成分与提取方法

日期：2017-12-15 标签：外泌体成分与提取方法

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外泌体的组成成分

外泌体主要有3大组成部分-蛋白质、核酸、脂质。众所周知，外泌体的脂质来源于细胞膜，属于磷脂双分子层结构，与细胞膜结构差异不大，故重点介绍外泌体中的蛋白与核酸。

外泌体中的蛋白可分为两大类，膜蛋白与膜内蛋白

膜蛋白

膜蛋白主要分两类，一类是几乎所有外泌体均含有的蛋白，这类蛋白可作为外泌体区别于其他囊泡（EVs）的标志物如（CD9，CD63，CD81，CD326）。

另一类是特异性膜蛋白，特定细胞分泌的外泌体上特有的。如A33（结肠上皮细胞来源）、MHC-Ⅱ、CD86(抗原提呈细胞来源-T细胞) 、乳凝集素（不成熟的树突状细胞）这些膜蛋白主要用于分离外泌体或分离来源于特定细胞的外泌体。

膜内蛋白

膜内蛋白主要包括热休克蛋白家族（(HSP60, HSP70, HSPA5, CCT2 和HSP90)、代谢类的酶（GAPDH,烯醇化酶 1, 醛缩酶 1, PKM2, PGK1）、核糖体蛋白（RPS3）、信号转导因子（黑色素瘤分化相关因子, ARF1, CDC42, ）粘附因子（MFGE8、整合素）、细胞骨架蛋白以及泛素。

核酸

 外泌体内的核酸包括DNA与RNA。在靶细胞内起作用的主要是RNA，外泌体内的RNA主要包括mRNA，microRNA，ncRNA，其中microRNA属于功能性RNA，他可以调节细胞内RNA和蛋白的水平，从而影响细胞的形态和功能。因此，microRNA是外泌体中研究最广泛最深入的RNA，且这些外泌体中的RNA往往与疾病的发生与发展有关。下表中介绍了许多与疾病有关的外泌体lncRNA和microRNA。

外泌体分离方法

无论是正常细胞还是癌细胞都会分泌外泌体。外泌体分布相当广泛，主要分布在血液、尿液、汗液、唾液、脑脊液、乳汁等体液系统中，我们要研究外泌体，首先要将外泌体从这些体液系统中提取出来

• 超速离心法

低转速离心，去除细胞或其他大颗粒杂质，然后超速离心沉降外泌体。

• 外泌体沉降法

即通过PEG或其他亲水试剂，将外泌体浓缩，低速离心后收集外泌体，市面上出售的外泌体提取试剂盒均采用此种方法。

• 过滤法

一开始通过大孔径滤膜滤掉细胞，再通过小孔径滤膜滤掉蛋白等杂质，最后通过0.1um的孔过滤，得到外泌体

• 免疫磁珠法

带有外泌体特异抗体的磁珠（如CD9,CD63，CD81，CD326）与样本孵育，用磁铁或离心等方法将外泌体分离出来

• 综合法

上述几种方法，方法一、二、三、提取的纯度不够，方法四、提取的量不够，我们可以将这两组方法综合起来，先用方法一、方法二、方法三粗略提取外泌体，再用方法四提纯外泌体。

外泌体提取后，我们要检测我们提到的是否是外泌体，加测方法主要有流式检测、WB检测（检测指标有CD9,CD63，CD81，CD326）、电镜观察。