DNA甲基化文献赏析之一： TET1介导FOXA1依赖性增强子的活跃表观遗传修饰

图1 FOXA1诱导TET1表达并与之互作调控增强子的表观修饰

    为了确定FOXA1和活性增强子标记之间的相关性，作者重新分析了先前发表的对照组和FOXA1敲低组的FOXA1，H3K4me2和H3K27ac ChIP-seq数据，以及进行了MeDIP和hMe-Seal的高通量测序分析确认FOXA1结合位点（FXBS）确实富含 H3K4me2和H3K27ac（图2A）, 并且虽然所有FOXA1占据位点周围5mC的平均强度在FOXA1敲低时没有受到很大影响（图2B），但5hmC显着下降（图2C），

而以FOXA1峰下游20kb的基因组区域（在本文中称为非峰位点）作为阴性对照的量度，没有表现出任何明显的模式（图2A：底部，图2D和E）。考虑到5hmC丰度仅占胚胎干细胞中5mC的大约10％，在5hmC比5mC中观察到更显着的变化是合理的。随后的MeDIP和hMe-Seal对各个FXBS基因进行qPCR，在许多FXBS中，FOXA1敲低后5hmC大大降低（图2F）。从这些结果可以推断，FOXA1可以在其占据的区域特异性地改变DNA甲基化以实现去甲基化状态，同时积累5hmC标记，从而增加增强子活化。

图2 FOXA1通过表观遗传修饰促进增强子活化。

A ChIP-seq、MeDIP和hMe-Seal高通量测序分析的热图呈现FXBS位点H3K4me2、H3K27ac、5hmC和5mC的富集；

B和C 显示的所有FXBS周围（A上）5mC（B）和5hmC（C）富集的平均强度图；

D和E 显示的所有非峰位点周围（A下）5mC（D）和5hmC（E）富集的平均强度图；

F 在对照和shFOXA1 LNCaP细胞对hMe-Seal进行的代表性FXBS基因Qpcr检测5hmC特异性变化。

（1）FOXA1正调控TET1的表达

   由于TET蛋白催化的DNA去甲基化，作者接下来检测TET基因表达是否与FOXA1相关。首先在一组12个前列腺细胞系中对FOXA1和TET1转录物进行qRT-PCR分析，结果表明TET1与FOXA1的表达趋势相似（图3A,B）。那么FOXA1是否调节TET1基因表达？为了测试这一点，首先检测了对照或FOXA1敲低的LNCaP细胞中的TET1水平，在FOXA1敲低后LNCaP细胞中TET1转录物和蛋白质水平均显着降低（图3C，D），同时，另一种独立的前列腺癌细胞系C4-2B中FOXA1的消耗也导致TET1表达的降低（图3E）。另一方面，当FOXA1在22Rv1和DU145细胞中过表达时，TET1表达增强（图3F,G）。为了在细胞水平上可视化FOXA1对TET1的诱导作用，进行了免疫荧光染色。在用空载体对照的DU145细胞中几乎检测不到TET1，在用腺病毒FOXA1感染（Flag标记，显示为红色）时，TET1染色（以绿色显示）显着增强（图3H）。这些数据支持FOXA1正调节TET1基因的表达。

图3 FOXA1诱导TET1表达

A和B q-pcr检测12个前列腺细胞系的FOXA1和TET1基因的表达

C和D 分别q-pcr和WB检测LNCaP细胞系中FOXA1敲低对TET1表达的影响

E 分别q-pcr和WB检测C4-2B细胞系中FOXA1敲低对TET1表达的影响

F和G WB检测22Rv1和DU145细胞系中FOXA1过表达对TET1表达的影响

H 免疫荧光检测FOXA1表达对TET1表达的影响

（2）TET1基因是FOXA1的直接靶标

为了确定FOXA1如何转录控制TET1表达，作者分析了先前从LNCaP细胞获得的FOXA1 ChIP-seq数据，并在TET1基因的外显子区域内，即外显子3和4之间观察到强烈的FOXA1结合（图4A）。与FOXA1通过增强子-启动子环化调节靶基因的增强子一致，作者还在TET1启动子处发现了弱的FOXA1结合。为了验证ChIP-seq的结果，进行了ChIP-qPCR，发现FOXA1在TET1增强子中相对于IgG对照富集了近170倍，并且在TET1启动子处约10倍（图4B），富集水平与前列腺特异性抗原基因增强子（PSA）相当。此外，在敲低后，富集水平大大减少（图4C）。接下来，为了检查TET1增强子和启动子处的FOXA1占据是否导致其转录活性的调节，作者将这些区域克隆到荧光素酶报道构建体中。荧光素酶测定显示FOXA1过表达确实显着增加而FOXA1敲低减少TET1增强子和启动子活性（图4D和E）。为了进一步证明该调节是由于TET1增强子和启动子的FOXA1占据，对TET1增强子和启动子内FKHD基序的FOXA1结合峰周围的DNA进行突变测定，荧光素酶测定显示FKHD基序的突变消除了TET1增强子的FOXA1调节以及启动子活性（图4F）。这些数据支持FOXA1直接结合TET1的调控元件以诱导其转录。

图4 FOXA1结合到增强子和启动子诱导TET1表达

A CHIP-seq数据分析表明FOXA1在TET1基因的启动子和增强子区域富集；

B和C CHIP-QPCR验证FOXA1在TET1启动子和增强子区域的富集；

D和E 荧光素酶实验验证FOXA1对TET1启动子和增强子活性的影响；

F 对TET1启动子和增强子区域FOXA1结合位点突变后的荧光素酶实验验证。

（1）FOXA1的FH结构域与TET1的CXXC结构域互作

由于FOXA1有助于局部DNA去甲基化（图2），TET1是已知的DNA去甲基化酶，作者假设TET1的作用可能归因于FXBS周围的DNA去甲基化。为了验证这一假设，作者研究了FOXA1和TET1蛋白之间的潜在相互作用。首先用Flag标记的TET1和FOXA1或空载体共转染293T细胞使用抗FOXA1抗体进行CO-IP，确认FOXA1能将TET1蛋白拉下（图5A），然后将TET1克隆到SFB标记的表达载体中，这使得能够使用S-蛋白琼脂糖珠下拉TET1蛋白并通过抗Flag抗体检测，CO-IP结果表明TET1蛋白能拉下FOXA1（图5B）。图5C则是直接的用蛋白本身的抗体相互IP证明两者具有细胞内源性互作。为了进一步确定与FOXA1的互作的TET1蛋白结构域，作者构建了四个Myc标记的TET1结构域构载体，即N末端，CXXC，中间和CD结构域，与用SFB标记的FOXA1共转染到293T细胞中。S-pull down下拉的WB显示仅含有CXXC模块的TET1片段能够结合FOXA1（图5D）。另一方面，为了找出与TET1蛋白互作的FOXA1结构域。类似地，构建了三个Flag标记的FOXA1结构域构建体，即N-末端，Forkhead（FH）和C-末端结构域，其与SFB标记的TET1-CXXC结构域共转染到293T细胞中然后进行S-pull down的WB检测，结果显示FOXA1的FH结构域与TET1的CXXC结构域互作（图5E）。

图5 FOXA1与TET互作

A-C CO-IP验证FOXA1与TET1的互作关系

D CO-IP检测与FOXA1结合的TET1结构域为CXXC

E CO-IP检测与TET1结构域CXXC结合的FOXA1结构域为FH

（2）TET1介导FOXA1依赖性增强子的表观遗传激活

为了确定TET1是否影响FOXA1占据的增强子的表观遗传修饰，首先测试TET1是否能够共同占据FOXA1结合的基因组区域。通过ChIP-qPCR表明在表达HA-TET1的细胞中比在用HA-对照载体转染的细胞中FXBS富集更强的HA（TET1）富集（图6A）。接下来，为了检测TET1如何改变这些FOXA1结合区域周围的DNA甲基化，shRNA进行了TET1敲低（图6B）。然后通过hMe-Seal-seq检测5hmCTET1敲低后总5hmC富集区域显着减少（图6C）和MeDIP-seq检测5mC显示增加了近33％（图6D）。所有峰的平均强度视图显示hMe-Seal信号显着降低，而MeDIP信号在TET1敲低后增加（图6E）。围绕FXBS的基因增强子表观遗传修饰的分析在TET1耗尽后总体减少5hmC和增加5mC，表明TET1对于维持这些增强子的去甲基化状态是关键的（图6F和G）。由于已显示DNA甲基化抑制增强子激活，接下来检测TET1敲低是否阻止FXBS的增强子激活。ChIP-qPCR显示在TET1耗尽后H3K4me2和H3K27ac确实均显着降低（图6H和1）。进一步ChIP-seq证实了TET1敲低中H3K4me2水平的全局下降（图6J）。这些数据支持TET1表达通过介导活性DNA去甲基化促进FOXA1-靶标增强子的活化。

图6 TET1表达通过介导活性DNA去甲基化促进FOXA1-靶标增强子的活化

A HA-TET1 CHIP-QPCR检测表明TET1在FXBS位点富集

B WB检测TET1敲低效果

C hMe-Seal和MeDIP-seq数据分析表明TET1敲低后5hmC显著降低5mC增加

E hMe-Seal平均强度视图

F-G hMe-Seal和MeDIP-seq数据分析聚焦于FXBS位点

H-I CHIP-QPCR检测FXBS位点的H3K4me2和H3K27ac的富集表明TET1敲低后FXBS位点富集降低

J ChIP-seq证实TET1敲低中H3K4me2水平的全局下降

报道DNA甲基化和H3K4me2去除可能损害FOXA1结合，在TET1耗尽后观察到的DNA甲基化和组蛋白修饰的变化提示FOXA1向这些区域的富集被破坏。为了测试这一点，作者在对照和TET1敲低LNCaP细胞中进行FOXA1 ChIP-seq以确定TET1消耗是否能够调节FOXA1染色质靶标。结果显示在TET1敲低时，FOXA1结合能力显著降低（图7A）。此外，即使对于TET1敲低后未完全消除的位点（即共享位点），FOXA1结合的平均强度似乎也弱得多（图7B）。几种依赖于FOXA1的增强子的基因组视图进一步说明了TET1耗尽细胞中FOXA1占据的显着丧失（图7C和D）。同时，这些增强子的DNA甲基化增加，即5mC增加但5hmC信号减少，而活性增强子标记H3K4me2减少，与全基因组切换到抑制性染色质状态一致。此外，ChIP-qPCR证实TET1敲低显着降低多个靶标增强子的FOXA1占有率（图7E）。由于TET1通过其CXXC结构域与FOXA1蛋白相互作用但通过其CD结构域进行酶活性，我们接下来试图从机理上理解CD介导的DNA去甲基化是否足够促进FOXA1招募到靶标增强子。为了测试这一点，作者用TET1敲低在LNCaP细胞中过表达CD结构域。 ChIP-qPCR确认TET1敲低使靶向增强子的FOXA1结合降低，重要的是，可以通过伴随的CD结构域过表达完全挽救（图7F）。这些数据支持TET1通过活性去甲基化促进FOXA1募集到靶标增强子

图7 TET1通过活性去甲基化促进FOXA1募集到靶标增强子

A-B CHIP-SEQ统计FOXA1富集量表明TET1敲低后FXBS位点显著降低

C-D SEQ视图显示TET1耗尽FOXA1占据靶标降低，活性增强子标记H3K4me2减少，5mC增加但5hmC信号减少

E ChIP-qPCR证实TET1敲低显着降低多个靶标增强子的FOXA1占有率

F ChIP-qPCR确认TET1敲低使靶向增强子的FOXA1结合降低，重要的是，可以通过伴随的CD结构域过表达完全挽救