CHIRP 免疫共沉淀实验

CHIRP(Chromatin Isolation by RNA Purification)是一种检测体内与RNA绑定的DNA和蛋白相互作用的方法，可同时分析lncRNA/circRNA 、蛋白及DNA三者互作关系。利用ChIRP-seq技术可用于在全基因范围内定位lncRNA/circRNA的结合位点和可能结合的其他RNA分子,是揭示位于细胞核内lncRNA/circRNA 生物学机制的关键实验手段。该方法是通过设计与目标RNA序列反向互补的生物素探针，把目标RNA拉下来以后，与其共同作用的DNA染色体片段就会附到链霉亲和素磁珠上，最后通过qRT-PCR或测序来测定目的RNA、DNA序列，亦或是通过Western或质谱分析来测定蛋白

技术优势：

（1）、CHIRP实验可研究细胞体内互作；

（2）、CHIRP实验既同时可研究RNA、蛋白质和DNA形成的复合体之间的互作；也可研究它们之间的两两互作；

（3）、利用CHIRP-MS实验寻找与目的lncRNA结合的蛋白，可不受lncRNA长度的限制；

（4）、利用CHIRP实验可研究circRNA与蛋白质或DNA之间的互作。

技术流程：

（1）、CHIRP-RNA：探针设计与合成→细胞交联→细胞裂解、超声处理→探针杂交→复合物纯化→RNA回收与纯化→NGS或qRT-PCR检测；

（2）、CHIRP-DNA：探针设计与合成→细胞交联→细胞裂解、超声处理→探针杂交→复合物纯化→DNA回收与纯化→NGS或qPCR检测；

（3）、CHIRP-Protein：探针设计与合成→细胞交联→细胞裂解、超声处理→探针杂交→复合物纯化→蛋白分离→质谱鉴定。

ChIRP实验标准实验分组如下：

（1）、IP组：目标lncRNA/circRNA Odd组和Even组（即实验组，用于鉴定lncRNA/circRNA作用基因组位置）

（2）、lacZ组：外参对照组，证明ChIRP探针的特异性；

（3）、Input组：捕获前分离提取的基因组DNA，作为内参对照组，证明探针特异性；

（4）、Positive组：阳性对照组，通过已知验证有效的探针，通过WB检测已知结合蛋白质，证明整个ChIRP实验体系的有效性；

（5）、目标lncRNA/circRNA qPCR：证明ChIRP探针对目标lncRNA的正确结合及有效捕获。

案例分析：

案列1：ChRIP-protein研究

结果解析：图A展示的整个ChIRP-WB或ChIRP-MS实验大致的实验流程；图B阐述的是ChIRP实验中U1探针和U2探针富集到的RNA长度分布，结果显示，input组的RNA大小为150-4000nt不等，而U1探针和U2探针富集的RNA长度为150-200nt，说明U1探针和U2探针能有效地富集样本中的U1和U2；图C是U1、U2、U3的ChIRP-WB实验结果，实验结果证明，U1和U2可与U1A蛋白结合，U3可与FIBRILLARIN蛋白结合。

参考文献：Systematic discovery of Xist RNA binding proteins，figuer1.

案列2：ChRIP-DNA研究

结果解析：图A展示的是通过生物信息学分析，预测出lncRNA FOXD2-AS1与TRIB3 Promoter的三个结合位点；图B是lncRNA FOXD2-AS1在UM-UC-3细胞中进行ChIRP-qPCR实验结果；图C是ChIRP实验中lncRNA FOXD2-AS1的奇数探针和偶素探针的富集效率检测结果。综合实验结果表明，lncRNA FOXD2-AS1可与TRIB3 Promoter结合，且结合位点位于预测位点的P3位点。

参考文献：The long non-coding RNA FOXD2-AS1 promotes bladder cancer progression and recurrence through a positive feedback loop with Akt and E2F1，figuer6.

案列3：ChRIP-circRNA-protein研究

结果解析：图a展示的是图b、c、d实验的简单实验流程图；图b是利用circRNA探针进行的类似ChIRP实验原理的RNA pulldown结果；图c是对图a的circRNA-RNA pulldown产物进行qPCR的实验结果；图d是利用circRNA探针进行ChIRP-qPCR实验结果。综合实验结果表明，circEIF3J和circPAIP2能与RNA聚合酶复合体结合，也能与本身目基因启动子结合从而调控母基因的表达水平。

参考文献：Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus，figuer5.

案列4：ChRIP-circRNA-miR研究

结果解析：图A展示的是circPVT1与microRNA结合位点的预测结果；图B是类似ChIRP实验原理的circRNA pulldown原理图；图C是对circRNA-RNA pulldown产物进行circPVT1的qPCR的实验结果，该结果反映的是circPVT1探针的有效性；图D是circRNA-RNA pulldown产物进行microRNA qPCR检测的实验结果。综合实验结果表明，circPVT1能与has-let-7有效结合，从而达到富集细胞内的游离的has-let-7，进而间接调控has-let-7的下游靶基因。

参考文献：Identification of senescence-associated circular RNAs(SAC-RNAs) reveals senescence suppressor CircPVT1，figuer4.

样本要求：

细胞数量：细胞数量需要达到108个；提供活细胞样本。

实验周期：

50个工作日。

公司提供：

实验报告（材料、试剂、仪器、方法、数据分析、实验结果）。

其他注意事项：

1、目标lncRNA/circRNA的表达丰度：

2、如果目标lncRNA/circRNA表达丰度较低，需要进行过表达以确保ChIRP成功；

• 1 . 基因表达调控
  • 1.1. 表观遗传修饰调控
  • 1.2. 转录水平调控
  • 1.3. 转录后水平调控
• 2 . 基因表达调控实验技术
  • 2.1. CHIP 染色质免疫沉淀技术
  • 2.2. RIP RNA结合蛋白免疫沉淀技术
  • 2.3. CHIRP 免疫共沉淀实验
  • 2.4. CLIP实验技术
  • 2.5. RNA pull-down
  • 2.6. DNA pull-down
  • 2.7. RNA-RNA pull-down
  • 2.8. Luciferase 荧光素酶实验
  • 2.9. DNA/RNA EMSA 凝胶电泳迁移实验
  • 2.10. FISH 免疫荧光原位杂交技术
  • 2.11. ​核质分离