全基因组分析前列腺癌细胞中HOXC4和HOXC6调 控的基因和结合位点

图1. HOX蛋白介导的前列腺癌转录组调控的竞争模型。

左图：HOXB13在正常前列腺组织中表达，与其靶位点结合并调节前列腺转录组。正常前列腺细胞中HOXC6的水平非常低，因此该TF对基因调节没有帮助。右图：HOXC6在前列腺肿瘤中异常表达，高水平的HOXC6蛋白与HOXB13竞争共同结合位点的占据。结合的HOXC6可能会增加癌基因的表达（如果它募集了一种共激活因子）或降低肿瘤抑制因子的表达（如果它募集了共抑制因子）。

    为了研究HOXC家族成员与前列腺癌之间的关系，作者使用22Rv1细胞作为模型系统来研究HOXC4和HOXC6。以HOXC4或HOXC6m RNA为靶点，用siRNA进行分别敲除和双敲除，处理后差异表达的基因火山图表明，尽管HOXC4和HOXC6都减少了大约相同的量，但受HOXC6敲低影响的基因数量大于受HOXC4敲减影响的基因数量（图1A）。由于两个TF 的DNA结合结构域非常相似，因此，作者还进行了HOXC4和HOXC6的双重敲除，并鉴定了在同时敲除两个HOXC TF时被解除调节的更大基因集（图1B），表明这些TF具有至少部分冗余的功能。通路分析显示，HOXC4或HOXC6的siRNA敲低后被下调的基因与癌症和细胞周期有关（图1C）

图2.HOXC6和HOXC4调控的基因的鉴定。

（A）在siRNA介导的HOXC6、HOXC4或两者同时敲除后，基因上调或下调的火山图。为便于显示，这些基因的调整p值未显示为刻度；

（B）韦恩图，比较在敲除HOXC6、HOXC4或两者同时进行的基因下调（左图）或上调（右图）。

（C）敲除HOXC6/HOXC4后下调基因的通路分析。

   由于RNA-seq分析表明HOXC4和HOXC6可能具有冗余功能，因此作者接下来想确定它们在全基因组范围内的结合情况。使用带有Flag标签的HOXC6和HOXC4蛋白进行CHIP-seq分析，HOXC6的CHIP-SEQ分析表明，约73％的HOXC6峰包含典型的富AT的HOX结合基序，该基序位于峰的中心（图2A 上）。然后，作者注释了HOXC6结合位点相对于它们在特定基因组特征中的位置。发现HOXC6峰通常位于远端基因间区域或内含子中（图2A 中）。对HOXC6峰距最近的转录起始位点（TSS）的距离进行了类似的注解，发现HOXC6主要结合到距TSS上游或下游10 kb远的调节元件上（图2A 下）。HOXC4的ChIP-seq实验，确定了位于峰中心的富含AT的基序并且观察到与HOXC6相似的峰分布，该峰与TSS的距离和基因结构有关（图2B）。

图3.大多数HOXC4和HOXC6结合位点都远离TSS。

（A）上图：显示的是在所有HOXC6结合位点集中确定的最高等级的从头基序； 在以HOXC6峰为中心的-/ + 250bp窗口内显示了基序的富集。 中图：显示的是HOXC6峰相对于基因结构的位置。 下图：显示的是HOXC6峰相对于距最近的TSS的距离的位置。

（B）与（A）图相同，但是是针对HOXC4结合位点。

   HOXC4和HOXC6的远侧结合模式表明它们可能是增强子结合的TF。通常将增强子鉴定为以H3K27Ac标记的开放染色质区域。因此，为进一步表明HOXC结合位点，作者使用测序（ATAC-seq）数据转座酶处理染色质的公开检测方法确定了HOXC4或HOXC6峰是否位于开放染色质区域。结果表明大多数HOXC6和HOXC4结合位点不在开放染色质中（图3A）。由于大多数HOXC4和HOXC6结合位点不在ATAC-seq识别的区域内，这使得作者进一步研究了峰的特征。HOXC6和HOXC4的结合强度在H3K27Ac +或H3K27Ac-峰和ATAC-seq +或ATAC-seq峰处大致相等（图3B），这表明HOXC6和HOXC4结合在核小体占据的染色质区域与无核小体、活性增强子的TFs结合一样。

图4.大多数HOXC6和HOXC4结合位点位于核小体占据的区域。

（A）显示了以HOXC6或HOXC4峰的基因组位置为中心的ATAC-seq和H3K27Ac ChIP-seq数据的标签密度图和热图。

（B）显示的是HOXC6和HOXC4峰的标签密度图，分为H3K27Ac标记或未标记的组以及ATAC-seq鉴定为或未鉴定为开放染色质的位点。

   有研究表明，果蝇中的不同HOX基因可以与相似的基因组位点结合。为了测试在前列腺癌中上调的人类HOX基因是否也是如此，作者比较了HOXC6和HOXC4的结合位点。发现大多数HOXC4结合位点与HOXC6结合位点重叠（图4A）。因为HOXB13 DNA结合结构域与HOXC6 DNA结合结构域相似为73.7％，所以作者用HOXB13抗体，在22Rv1细胞中进行HOXB13 ChIP-seq。发现37％的HOXB13结合位点也被HOXC4和HOXC6结合。HOXC4或HOXC6共共有2321个HOXB13峰（图4A）。HOXC4，HOXC6和HOXB13共同结合的峰的特征表明，大多数共同结合的位点位于远距离基因间隔区或内含子区域内，距离TSS超过10kb（图4B）。

图5. HOXC6，HOXC4和HOXB13与一组常见的调控元件结合。

（A）显示的是比较HOXC6，HOXC4和HOXB13结合位点的三向维恩图。

（B）上：显示的是HOXC6，HOXC4和HOXB13共结合位点相对于基因结构的位置。下：显示的是HOXC6，HOXC4和HOXB13共结合位点相对于距最近的TSS的距离的位置。

   因为已有报道HOXB13，FOXA1和AR可以共定位于常见的结合位点，所以作者将HOXC4和HOXC6结合位点与FOXA1和AR结合位点进行比较。进行了ChIP-seq识别22Rv1细胞中的FOXA1位点。并使用了两种不同的FOXA1抗体和IDR确认两种抗体都检测到相似的结合位点。作者发现，HOXC4或HOXC6结合位点的强度与关键前列腺癌转录因子HOXB13，FOXA1和AR的结合位点之间存在显著的相关性（图5A）。然而，只有一个结合位点的子集被所有5个TFs绑定。有趣的是，这个位点的子集是位于以H3K27A为标记的开放染色质中的位点（图5B）。

图5. HOXC6，HOXC4，HOXB13，FOXA1和AR与活性增强子共结合。

（A） 显示的是HOXC4，HOXC6，HOXB13，FOXA1，和AR热图以HOXC4，HOXC6，HOXB13，FOXA1或AR结合位点的基因组位置为中心。每行代表该行旁边显示的TF结合位点的基因组位置。在每一列中，红色框概述了给定因子的结合位点，该位点映射在同一因子的结合位置。

（B）显示的是HOXC6，HOXC4，HOXB13，FOXA1，AR，ATAC-seq，H3K27Ac和H3K4me1数据（以列标题表示）的标签密度图和热图，这些数据以与HOXC6，HOXC4和HOXB13共同结合的位点的基因组位置为中心。