染色质开放性分析揭示了TEAD1作为人胶质母细胞瘤中的迁移调节因子

作者为了对GSCs与NSPCs细胞中染色质开放性进行研究，利用CD24/34/45-PE抗体通过流式细胞术从神经胶质瘤（GBM）与神经基质（GM）中分离具有干性的GSCs与NSPCs细胞。细胞膜上是否具有EGF的受体蛋白可作为判断细胞是否处于增殖期，因此利用EGF-APC抗体把GSCs分为E-GBM和E+GSC两个子集、把NPSC分为E-NPC和E+NSPC两个子集（图1a），然后分别对四个子集进行ATAC-seq测序分析。比较E-GBM与（E+GSC和E+NSPC）的ATAC-seq数据，获得了与干性细胞发育相关的5020个差异峰（图1b）。用基因注释工具（GREAT）对差异峰进行功能富集分析发现，GSC与NSPC共有基因的主要功能与维持细胞活性、细胞增殖相关（图1c）。作者将分析重点放在GSC和NSPC之间的差异，发现了10509个差异峰（图1d），并对差异峰进行基因注释和功能分析发现，GSC与NSPC差异基因的主要功能与细胞迁移、运动、细胞外基质（ECM）相关（图1e）。这表明GSCs主要以细胞迁移为主要特征。

   作者对四组的ATAC-seq数据进行motif分析，通过比较（E-GBM+NSPC）与E+GSC的ATAC-seq数据得出肿瘤特异性相关的转录因子列表（图2a）。比较E-GBM与（E+GSC和E+NSPC）的ATAC-seq数据得出干性细胞发育相关的转录因子列表（图2b）。对E+GSC/E-GBM细胞进行RNA-seq测序，检测多种转录因子表达情况，发现TEAD1在GSC中具有较高的表达水平，且在E+GSC中表达更高（图2c）。

为了评价TEAD1与GBM亚型的相关性，作者从TCGA数据库中获得了GBM中TEAD家族的RNA-seq数据，发现了TEAD1表达最高（图2d）。并且在作者分选细胞的RNA-seq数据中也得到了相同的结果（图2e）。

作者利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术在GBM中分别敲除TEAD1和TEAD4（图3a）。比较在无血清培养基中对照组与两个敲除组细胞的生长曲线，发现敲除TEAD1会导致生长抑制更加明显（图3b）。在低附着条件下比较三组细胞形成细胞球的数量（图3c）和球体的直径（图3d），TEAD1敲除株中细胞球的直径最小。Transwell侵袭实验（图3e）与细胞球体分散测定（图3f）中敲除TEAD1或TEAD4都会导致GBM迁移率减少的结果。最后，在TEAD1敲除组中恢复表达TEAD1，并观察细胞球体迁移（图3g），结果表明恢复表达TEAD1后能部分挽救敲除后的迁移缺陷。上述结果表明TEAD1/4与GBM的迁移能力相关。

作者使用TEAD1敲除细胞与GBM细胞在小鼠体内进行原位移植，来观察TEAD1在体内是否同样具有影响GBM细胞侵袭能力。在原位移植肿瘤细胞后3.5个月进行组织学分析，发现敲除TEAD1后导致体内细胞侵袭能力下降，处于增殖期的细胞数减少（图4a），组织中TEAD1蛋白表达下降（图4b），切片中肿瘤细胞的数量下降（图4c）。通过评价每张切面中肿瘤扩散的面积总和与肿瘤的体积（图4d）发现敲除组细胞扩散范围主要位于注射部位，而GBM组细胞在体内的侵袭范围较远（图4e）。以上结果表明，TEAD1在体内也会影响GBM的迁移能力。

根据RNA-seq与ATAC-seq数据分析基因表达与染色质开放性的相关性（图5a），结果显示中高水平基因表达与基因启动子中开放染色质存在的强相关性。对不同亚型的GBM细胞进行ATAC-seq分析，寻找TEAD1的靶基因（图5b），其中EGFR、AQP4和CDH4的染色质开放区域与TEAD1的motif有较强的相关性。用ChIP-PCR验证TEAD1与EGRF、AQP4、CDH4的结合情况（图5c），结果发现TEAD1与三个基因的结合能力较强。同时在敲除TEAD1会导致AQP4和CHD4蛋白表达水平下降（图5d）。以上数据表明TEAD1作为AQP4和CDH4的转录因子，参与调控AQP4和CDH4的表达。

已知EGFR与GBM的增殖、迁移能力相关，同时TEAD1也是EGFR的转录因子，因此作者进一步关注TEAD1与EGFR的关系。作者观察到在体内敲除TEAD1导致EGFR的蛋白水平表达下降（图6a），然后在体外GBM细胞中验证TEAD1与EGFR的调控关系，发现敲除TEAD1会导致EGFR表达下降、恢复TEAD1后EGFR的表达也得到恢复（图6b）。最后验证了EGFR下游两个通路的关键基因AKT和ERK的表达，发现敲除TEAD1会导致pERK下降（图6c）。

为了进一步寻找TEAD1参与调控细胞迁移的靶基因，通过比较ATAC-seq富集基因以及敲除TEAD1后GBM的RNA-seq数据，发现32个基因的染色质开放区域与TEAD1的motif有相关性。其中AQP4是三个下游靶基因中唯一一个直接受TEAD1调控的基因（图7a）。在后续的细胞球分散实验中，敲除了TEAD1而过表达AQP4能恢复因TEAD1缺失而引起下降的侵袭能力（图7b）。最后RT-QPCR结果表明在敲除组细胞中恢复TEAD1的表达能恢复AQP4的表达。这些数据进一步证明AQP4在GBM迁移中发挥作用，同时还证明了TEAD1和下游AQP4表达之间的直接机制联系。