ChIP-seq、ATAC-seq、RNA-seq联合解析PTEN-BRG1协同致死机制

    鉴于最近在癌症中靶向染色质调节因子方面的成功，作者基于CRISPR-cas9技术在PTEN敲除的22RV-1细胞及PTEN未敲除的22RV-1细胞进行了高通量测序筛选，以鉴定PTEN缺失的PCa细胞中特别需要的表观遗传调节因子。该筛选的表观遗传调节因子文库中包含517个基因，分别编码表观遗传的书写、擦除和识别。高通量测序初筛分别鉴定出PTEN-complete和PTEN-KD细胞中分别有47个和65个基因跟细胞生长相关，其中两种细胞类型中有33个基因重叠(图1C)，表明无论PTEN水平如何，这些基因可能对PCa细胞的生长都很重要。接下来，为了识别对PTEN缺陷肿瘤重要的表观遗传调控因子，作者将重点放在另外32个基因上，并使用单个siRNAs进行验证筛选，以比较PTEN敲除与否对22RV-1细胞的影响。MTT分析结果显示，BRG1是差异是最明显的(图1D)。BRG1敲除明显导致了PTEN-WT与PTEN-KD细胞的预期差异(图1D)。在对照中，SF3B1和DDX18等基因没有表现出这种选择性。有趣的是，多种SWI/SNF组分(如SMARCE1、SMARCA5等）在PTEN-KD细胞中均有预期差异，这表明SWI/SNF复合物可能对这些细胞具有生长优势。BRG1是SWI/SNF染色质重构复合物的酶亚基，可以被小分子抑制剂调节，因此作者选择BRG1进行进一步的分析。

为了评价BRG1在前列腺癌中的临床意义，作者使用预先验证的BRG1抗体开展了免疫组组化，免疫组化的样本自于由122个的亚洲根治性前列腺切除术组织芯片(TMA)。前列腺标本检查结果显示肿瘤组织中BRG1表达 (均数为4.8;n = 122)较正常组织高(均值为3.2;n BRG1免疫染色强度与肿瘤中Gleason评分和PSA水平呈正相关。BRG1水平升高的患者生化复发的风险更高(P = 0.0004;图1 f)。作者进一步根据PTEN水平对患者进行分层。Kaplan-Meier生存评估分析显示，BRG1蛋白水平与低PTEN表达的肿瘤预后不良呈正相关(P = 0.010;图1 g)。而在PTEN高表达的肿瘤中，BRG1的预后意义未达到统计学意义(P = 0.289;图1 g)。这些结果提示，在PTEN缺乏的情况下，BRG1的表达与前列腺肿瘤发生发展息息相关。

为了确定BRG1是否在pten缺乏的PCa细胞中是特别需要的，作者首先在一组PCa细胞系中研究了BRG1的功能。作者发现BRG1表达的减少显著降低了PTEN-null PCa细胞的生长，包括PC3、LNCaP和C4-2细胞(图2A)。BRG1 KD未改变PTEN-WT PCa细胞(22RV-1、BPH-1、LAPC4细胞)的生长(图2A)。在不依赖贴壁的生长试验中也证实了对BRG1的类似依赖性。除22RV-1细胞外，PC3和LNCaP细胞中BRG1的缺失严重抑制了菌落的形成。重要的是，作者发现PTEN缺失细胞(PC3和LNCaP细胞)中PTEN的恢复使它们对BRG1下调不敏感。接下来作者研究了BRG1的原致瘤功能是否依赖于其染色质重构活性。重新表达野生型的BRG1，能恢复BRG1缺失细胞的克隆形成和细胞迁移缺陷，而缺失atpase的BRG1则无此生物学功能(图2B)。

考虑到PCa细胞的遗传和表观遗传异质性，作者在同一细胞中单独或与同时敲除PTEN和BRG1。与预测一致，PTEN KD促进细胞增殖，仅BRG1敲除对22RV-1和LAPC4细胞的生长无明显影响(图2C)。与之形成鲜明对比的是，PTEN KD对BRG1耗竭有明显的增敏作用。作者发现PTEN/BRG1双KD将细胞生长抑制到基础水平(图2C)。这一结果被皮下成瘤试验结果进一步证明。作者发现PTEN-KD 22RV-1细胞更容易受到BRG1敲除的影响，这说明了PTEN和BRG1存在合成致死关系(图2D)。从肿瘤体积可以看出，PTEN-KD细胞中BRG1的耗竭明显减轻了肿瘤的发展进程。IHC分析表明，在PTEN-KD肿瘤中沉默BRG1导致细胞增殖显著减少和凋亡增加。为了进一步证明BRG1在PTEN-null PCa中是重要的，作者还进行了心脏内注射实验，以确定BRG1下调是否抑制了PTEN-null PC3细胞的转移潜能。生物发光成像(BLI)显示，注射BRG1-KD细胞的小鼠肿瘤细胞的骨定植明显减少(图2E)。与对照组相比，BRG1-KD组骨溶解明显减少(图2F)。随着骨转移的减少(E-cadherin+细胞)，抗酒石酸磷酸酶(TRAP)阳性染色在BRG1缺失后也随之减少(图2G)。综上所述，这些结果提示BRG1是pten缺失的PCa细胞发生肿瘤所必需的。

为了进一步确证BRG1-PTEN在体内的关系，作者利用GEMs来探讨BRG1与PTEN之间的遗传互作。因此，作者将Brg1fl/fl小鼠与Probasin-Cre (PBCre/+)小鼠杂交，以去除前列腺上皮细胞中的Brg1 (Brg1PC-/-小鼠)。对6个月大的Brg1PC-/-小鼠进行的前列腺组织学检查表明，仅Brg1失活不会导致前列腺叶的病理异常。接下来，作者将Brg1PC - / -小鼠与PtenPC -/-小鼠杂交(简称PtenPC-/-;Brg1PC-/-小鼠;图3A和图3B)。为了更好地观察肿瘤的进展，化合物小鼠也与Rosa26-LSL荧光素酶报告小鼠交叉。与PtenPC -/-小鼠相比，五个月（PtenPC -/-;Brg1PC -/-）小鼠的前列腺生物发光强度降低了2- 3倍(图3B)，表明在Pten-null小鼠模型中，BRG1的缺失抑制了肿瘤的进展。组织病理学检查证实Brg1的缺乏可抑制Pten-null前列腺肿瘤的进展。HGPIN区域的特征是细胞核异型性聚集细胞的粒内增殖，与（PtenPC-/-;Brg1PC-/-）小鼠相比，在PtenPC-/-小鼠的前列腺中HGPIN区域增大(图3中,C和D)。此外,12只PtenPC-/-小鼠中有3只小鼠发展成浸润型腺癌，如图3e所示，一些肿瘤细胞突破基质细胞 (SMAα染色)和入侵的前列腺基质(雄激素受体(AR)染色,箭头) 。与此相反，Pten和Brg1失活的小鼠在增生期或低分级PIN (LGPIN)期出现病变，且病变大部分被抑制，外显性不完全(图3,C和D)。同样，（PtenPC-/-;Brg1PC-/-）小鼠未见侵袭性腺癌的发生 (图3E)。通过Ki67染色，作者发现（PtenPC-/-;Brg1PC-/-）小鼠前列腺增生指数明显降低。总之，作者的研究结果表明BRG1对PTEN缺乏引起的前列腺肿瘤的进展起关键作用。

为了确定BRG1在PTEN缺陷的肿瘤细胞中的作用，作者运用了类器官培养平台，类器官培养能大体上模拟前列腺的组织学特征，包括在基底细胞中具有核AR表达和p63表达的多层结构。作者从（TMPRSS2-CreERT2-IRES-GFP;Ptenfl/fl）小鼠前列腺中分离出管腔细胞，如前所述。PTEN的缺失通过4-羟基他莫西芬(4-OHT)完成，BRG1通过慢病毒转导被敲除(图3F)。正如预测的那样，PTEN的缺失促进了类前列腺器官的形成，而BRG1的缺失并不影响PTEN-WT小鼠的类前列腺器官的起始能力或大小(图3F)。相比之下,作者发现BRG1缺失深深地影响了PTEN-deficient小鼠的前列腺类器官形成能力，诸如前列腺类器官的大小和Ki67 +细胞的数量(图3中,F和G)。为了更进一步确定BRG1是否是PTEN-deficient肿瘤特异需要的, 作者评估了BRG1 KD在前列腺c-Myc过表达小鼠的类器官培养中的作用。Myc扩增或过表达常见于人类肿瘤中，因此，该模型可能代表了与不同于PTEN缺失引起的的人类PCa。事实上，作者发现Brg1耗竭并不改变c-Myc过表达引起的致瘤潜能(图3H)。接下来，作者研究了其他常见的PCa基因改变，如p53缺失或SPOP多态，是否会影响PTEN与BRG1的合成致死关系。为此，作者使用Pten和Tp53双敲除小鼠(PtenPC -/-;Tp53PC -/-)，发现BRG1- KD仍能抑制类前列腺器官的生长。同样，患者来源的SPOP突变体(F133V)在PC3和22RV-1 PTEN-KD细胞中过表达也没有改变BRG1下调的敏感性。因此，GEMs和类器官培养实验共同证明了Brg1在pten突变的PCa中的关键和特殊功能。

下一步，作者的目标是探索PTEN缺失使细胞对BRG1耗竭敏感的分子基础。作者注意到，PTEN-null PCa细胞(PC3、LNCaP和C4-2细胞)中的BRG1蛋白水平高于正常前列腺上皮细胞(RWPE-1细胞和小鼠前列腺[mAP])或PTEN-WT PCa细胞(BPH-1、22RV-1和LAPC4细胞)(图4A)。在PtenPC-/-小鼠前列腺中也观察到类似的结果。与WT对照组相比，PTEN缺失组前列腺中BRG1蛋白水平(而非mRNA)明显升高(图4B)。重要的是，在PC3细胞中PTEN的重新引入导致了BRG1蛋白的显著降低，同时增加了BRG1多泛素化，而不影响BRG1 mRNA水平(图4,C和D)。这些观察结果表明，PTEN通过转录后调控来调控BRG1的表达。

在PTEN缺失的情况下，最显著的信号事件是AKT的组成性激活，它影响蛋白酶体依赖蛋白的降解(33,38)。事实上,作者研究结果表明通过siRNA-KD或LY294002处理抑制AKT信号通路，降低了BRG1蛋白的稳定性但不改变其mRNA水平(图4中,E和F)。利用 MG132和LY294002共处理细胞，能阻碍BRG1蛋白的降解(图4),这就强调了PTEN缺失激活AKT轴增强BRG1蛋白的稳定性是依赖于蛋白酶体的。AKT磷酸化糖原合成酶kinase-3β(GSK3β)第9位的丝氨酸并抑制其激酶活性(39-41)。因此作者推断,PTEN缺失增强BRG1的稳定性通过降低GSK3β活性来实现的。为了验证这种推断,作者首先证明了在细胞内BRG1能与GSK3β互作(图4 g)。GST pull-down的结果分析表明,BRG1羧基端 (aa1300-1647)对BRG1与GSK3β之间的直接联系负责。从功能上来说, 在HEK293细胞中过表达表达野生型或者持续激活的GSK3β(GSK3β-S9A)能缩短BRG1蛋白的半衰期。更重要的是,在AKT敲除的PC3细胞中，消耗GSK3β能延长BRG1蛋白的半衰期,表明PTEN-AKT稳定BRG1蛋白是通过GSK3β来实现的 (图4h)。患者标本分析证实了PTEN对BRG1的调节作用。122个PCa样本中BRG1与PTEN蛋白呈负相关(r = -0.427, P < 0.0001;图4)。总之,作者的结果表明, 在PCa细胞中，PTEN/AKT/GSK3β信号轴调控着BRG1的稳定性。因此，在PTEN缺乏的肿瘤中BRG1上调，这可能导致细胞依赖于BRG1的存在。

作者试图明确PTEN/AKT/GSK3β调节BRG1稳定性的调控机制。先前的研究已经报道,GSK3β直接磷酸化底物,便于识别后续的蛋白降解的E3连接酶。有趣的是,共识序列比对发现在BRG1的羧基端的S1417和S1421位置有一个进化保守的GSK3β磷酸化序列(XpS/TGXXpS/T) (图5)。质谱实验验证结果表明在HEK293细胞BRG1的S1417和S1421位点均被磷酸化,且这些磷酸化信号在GSK3β表达后会进一步加强。为了确定GSK3β是否直接磷酸化BRG1,作者进行体外激酶实验。结果表明,只有野生型的BRG1能被GSK3β有效磷酸化,而突变的BRG1-S1417A/S1421A (BRG1-SA)则不能被磷酸化(图5 b),这就说GSK3β是直接对BRG1的S1417/1421位点进行磷酸化。作者进一步生产了一种抗体，这种抗体可以识别BRG1在S1417/1421位点的磷酸化。重新恢复PC3细胞中PTEN的表达能明显增强内源的phospho-BRG1-S1417/1421水平,而GSK3β激酶抑制剂CHIR-99021处理能极大地削弱了这个磷酸化(图5)。值得注意的是,λ-phosphatase处理实验证实GSK3β磷酸化BRG1-S1417/1421是特异的(图5)。

FBXW7和β-TrCP是已知的Skp1-Cullin1-F-box蛋白类的E3泛素连接酶，它们与PTEN/GSK3β-mediated蛋白质降解有关。作者发现使用siRNA-KD沉默FBXW7极大地增强了BRG1在PCa细胞中蛋白质含量，但沉默β-TrCP则无此效果。同样FBXW7过表达刺激了PC3细胞中BRG1的多泛素化(图5D)。与此相应地，干扰FBXW7可恢复AKT缺失细胞中的BRG1蛋白水平(图5E)，从而确定了PTEN-AKT和FBXW7调节BRG1稳定性的因果关系。接下来,作者进行了一次体外泛素化分析实验来确定是否确实FBXW7靶向BRG1,使其磷酸化进而降解。抗泛素抗体IB显示，当丙氨酸取代丝氨酸(BRG1-S1417A/S1421A, BRG1-SA)时，多泛素化的BRG1明显减少，而模拟磷酸化的BRG1-S1417D /S1421D (BRG1-SD)蛋白比WT蛋白表现出更明显的多泛素化(图5F)。同理，外源表达的BRG1-SD蛋白与WT BRG1蛋白相比具有更高的泛素化转化率，而BRG1-SA在HEK293细胞中更为稳定。作者进一步证明了P-S1417/1421-BRG1促进了HEK293细胞中FBXW7与BRG1的直接结合。同时BRG1-SA与FBXW7表现出分离状态，而模拟磷酸化的BRG1-SD蛋白与FBXW7的结合则更强(图5G)。

为了证实上述观察的现象，作者利用CRISPR-Cas9技术将内源性BRG1中的S1417/1421替换为PC3细胞中的Ala或Asp，从而分别生成SA和SD细胞(见图5E)。事实上，BRG1-SD蛋白表现出更明显的降解和多泛素化，而BRG1-SA比其WT对应物则更稳定(图5H)。MG132处理减弱了BRG1-SD蛋白的加速降解效果。随着SA细胞中BRG1磷酸化水平的降低，BRG1与FBXW7的结合减少，而在SD突变体中，BRG1与FBXW7的结合则增加(图5I)。总之,这些结果表明, GSK3β介导的BRG1-S1417/1421磷酸化促进了SCF-FBXW7 E3连接酶对其识别,进而导致BRG1降解。在异种移植模型中作者进一步评估了BRG1-S1417/1421磷酸化的意义(图5J)。作者发现SA细胞更具有致瘤性，而SD细胞来源的异种移植物明显小于WT PC3细胞来源的异种移植物。进一步对PCa标本进行分析发现，30个PCa标本中PTEN与p-S1417/1421水平密切相关(r = 0.688, P = 5.5×10-5;图5 K)。此外，BRG1与p-S1417/1421水平呈负相关(r=-0.600, P=0.0007;图5K)。这些结果都证明PTEN/AKT/GSK3β轴通过FBXW7依赖的泛素蛋白酶体途径来调节BRG1的降解。

为了研究PTEN缺陷肿瘤依赖于BRG1上调的原因，作者对伴有或不伴有PTEN敲除的BRG1缺失的22RV-1细胞进行了转录组分析。通过对差异表达基因(DEGs)的聚类分析，作者发现PTEN/BRG1双敲除细胞中5489个基因的表达发生了显著变化，而这些基因在Control、BRG1- KD和PTEN-KD细胞中表达模式明显不同。与这些结果一致的是，KEGG-DEG关系网络表明，PTEN缺失细胞中的BRG1缺失显著改变了PCa进程、细胞周期及细胞运动相关的过程。通过RT-qPCR实验进一步验证所选基因的差异表达，并将结果汇总成heatmap图(图6A)。为了鉴定BRG1介导的下游靶点和通路，作者对对照细胞和PTEN-KD的22RV-1细胞进行ChIP-Seq分析。PTEN缺失导致BRG1在BRG1峰值的全局占用率增加(图6B)。PTEN-KD细胞中共有6279个基因(67.9%的BRG1结合基因)表现出比对照细胞更强的BRG1结合。考虑到BRG1是激活核小体的ATP酶的核心亚基，作者推断PTEN缺陷细胞中的BRG1敲除可能损害了染色质构型。为了验证这种可能性，作者进行了染色质可及性测序(ATAC-Seq)，以比较PTEN-KD和PTEN/BRG1-KD细胞之间的开放染色质区域(OCS)。全基因组ATAC-Seq强度图显示，与完整的BRG1细胞相比，BRG1敲除的PTEN-KD细胞中导致了60%以上的OCR减少。与PTEN-KD细胞相比，PTEN/BRG1-KD细胞中有60740个DNA可及性降低的峰(图6C)。(图6D)展示的是少数代表性的染色质可及性测序峰图，其结果表明BRG1缺失导致ETV-1和cav2基因位点的DNA可达性降低。总之，作者的结果表明BRG1的敲除导致了PTEN缺失肿瘤中染色质动力学的显著变化。

为了鉴定PTEN缺失的PCa中BRG1的可能靶点，作者将BRG1的峰值与OCR和DEGs的变化进行比对;其中有553个基因重叠，这些重叠基因被称为PTEN依赖性的BRG1信号 (图6E)。KEGG-Pathway分析发现，这些基因与调控干细胞多能性的信号、轴突引导、肿瘤转录失调、MAPK信号通路相关。接下来，作者发现将PTEN依赖性的BRG1信号通过K 均值聚类分析将患者分成两组，两组在生化复发风险上有显著差异(图6F)。此外，通过比较PTEN-WT和PTEN-null肿瘤中不同表达量的基因集，作者发现PTEN-null肿瘤具有较高的BRG1信号活性。

虽然很难将BRG1功能归为一个离散的靶基因，但作者测量了几个已知对前列腺肿瘤发生有重要意义的基因的表达。选取PCa、MAPK信号中关键调节因子的代表基因，以及表观遗传调节因子，包括c-Myc、ETV-1、NCoA2、ERRB2、FGFR3、K-Ras、Sin3A、BMI1和DOT1L(图7A)。ChIP-qPCR实验证实BRG1存在于这些基因位点，这与该亚基在SWI/SNF靶向定位中的直接作用一致(图7B)。ChIP-qPCR结果显示，BRG1缺失显著降低了c-Myc、ETV-1、K-Ras和BMI1基因位点的H3K9ac水平(图7B)。由于H3K27ac能区分活跃的和不活跃的染色质(45)，作者一致检测到在同一位点H3K27me3同时增加(图7B)。这些结果表明BRG1的缺失有利于抑制染色质状态，从而抑制基因表达。聚焦于c-Myc和MAPK信号,作者确认, 与PTEN-deleted细胞相比，PTEN/BRG1-KD细胞中c-Myc表达和p-ERK激活下调到本底水平在 (图7中,C和D)。接下来,作者将作者的分析扩展到基因工程小鼠，其结果显示, 与PtenPC -/-小鼠相比，（PtenPC -/-;Brg1PC -/-）小鼠中c-Myc和p-ERK水平明显减少 (图7E)。此外，在前列腺癌患者中，BRG1转录组与c-Myc和MAPK信号相关基因密切相关。总之，这些数据表明，BRG1重构了PTEN缺失的PCa细胞的染色质结构，并启动了涉及c-Myc和MAPK信号的原癌基因转录组，导致细胞变得依赖于BRG1。

最后，作者使用PtenPC-/-小鼠进行了临床前研究，这些小鼠在2.5个月大时随机接受溶剂处理或PFI-3处理，这是一个可以识别PIN的时间点。MRI结果显示，PFI-3处理显著降低了肿瘤体积(平均肿瘤体积减少约43%)，所有小鼠的病理反应接近完全(n = 5;图8 e)。与溶剂组的肿瘤特征相反，PFI-3处理小鼠的肿瘤特征为增生或LGPIN(图8F)。一致地， PFI-3抑制剂处理的PtenPC-/-肿瘤显示ki-67阳性有丝分裂细胞的频率急剧下降，同时诱导细胞凋亡。值得注意的是，PFI-3在小鼠中耐受良好，因为它没有造成显著的体重下降、嗜睡或喂养异常。因此，PFI-3药物抑制SWI/SNF重构复合物在治疗PCa小鼠模型中得到了有益的结果。