DNA甲基化研究案例（一）

一、调控通路

在正常细胞中，为了维持平衡，KIF14基因启动子的DNA是以甲基化状态存在；当细胞发生癌变时，转录因子SP1和YY1结合到KIF14基因启动子上促使DNA去甲基化从而促进KIF14的表达。另外，本文还简单的表明了miR-382抑制KIF14的表达。

二、实验流程

作者首先通过荧光素酶活性实验说明了转录因子SP1、YY1的KIF14启动子活性的影响，然后建立SP1和YY1敲低细胞株检测KIF14的表达；为了进一步验证SP1、YY1与KIF14启动子的关系，作者先用CHIP实验验证了SP1、YY1与启动子的结合，然后通过甲基化PCR实验说明SP1和YY1促使KIF14启动子的DNA去甲基化；最后作者通过检测KIF14高表达/低表达细胞中microRNA的表达和microRNA敲低后的KIF14 Mrna的表达简单的说明miR-382抑制KIF14 mRNA的表达。

三、核心FIGURE

Figure1说明的是转录因子SP1和YY1与KIF14启动子互作影响该基因的表达。

A、 启动子荧光素酶活性实验，表明转录因子SP1和YY1影响KIF14启动子活性。

B、 Qpcr检测转录因子SP1和YY1敲低后KIF14 mRNA的表达，表明SP1和YY1敲低后KIF14 mRNA水平下降。

C、 WB检测转录因子SP1和YY1敲低后KIF14蛋白的表达，明SP1和YY1敲低后KIF14蛋白水平下降。

Figure2说明的是转录因子SP1和YY1结合到KIF14启动子上促进DNA去甲基化。

A、 CHIP实验，分别用转录因子蛋白SP1和YY1抗体钓取结合的DNA片段，然后进行Q-PCR检测，结果表明肿瘤细胞的SP1和YY1与KIF14启动子高度结合。

B、 甲基化分析，用甲基化特异引物进行q-PCR检测正常细胞和肿瘤细胞的KIF14启动子DNA甲基化情况，结果表明肿瘤细胞去甲基化程度上升。

Figure3说明的是miR-382抑制KIF14的表达。

A、Q-PCR检测KIF14高表达和低表达细胞的microRNA，筛选出几个差异表达的microRNA。

B、通过对micro的抑制检测KIF14 mRNA的表达情况，结果表明miR-382受抑制后KIF14 mRNA表达上升，说明miR-382可抑制KIF14的表达。

本公司可提供的技术服务

本公司可进行以上类似实验的实验设计及整体实验外包项目，包括Q-PCR、Western Blot、Luciferase检测、CHIP、慢病毒稳转株的建立（过表达/敲低），其中的Luciferase检测、CHIP为本公司主营项目。

一、 Luciferase检测：

作者分别将YY1、HSF1、SP1表达载体与KIF14启动子荧光素酶载体转染细胞，然后检测荧光素酶活性。

二、 CHIP技术：主要研究蛋白与基因启动子之间的关系。

作者分别用SP1和YY1抗体钓取细胞中与蛋白结合的DNA片段，然后进行Q-PCR验证，表明肿瘤细胞的SP1和YY1与KIF14启动子高度结合。

参考文献：Brigitte L.The ´riault,Halesha D.Basavarajappa, Harvey Lim,et al.Transcriptional and Epigenetic Regulation of KIF14 Overexpression in Ovarian Cancer［J］.PLoS ONE,2014,9(3):e91540.