DNA甲基化研究案例（三）

一、调控通路

胆管癌细胞的Dicer高度表达后进入细胞核，与HP1α蛋白复合体结合互作，促进SFRP1启动子的组蛋白和CpG岛DNA甲基化，从而抑制SFRP1的表达。

二、实验流程

作者首先通过免疫组化检测胆管癌细胞和癌旁组织细胞的Dicer的表达情况表明胆管癌细胞的Dicer高表达，然后对细胞进行核质分离后分别检测Dicer含量表明高表达的Dicer大部分进入细胞核。为了研究Dicer的作用机制，分别进行GST pull-down和co-IP实验验证了Dicer进入细胞核中与HP1α蛋白复合体结合互作，随后作者对Dicer敲低后的细胞系检测组蛋白的甲基化情况表明Dicer使染色体组蛋白甲基化。为了说明Dicer促进SFRP1启动子甲基化，作者进行CHIP实验验证Dicer、HP1α、H3k9me3结合，并通过重亚硫酸盐PCR检测SFRP1启动子的CpG岛甲基化情况表明Dicer促进DNA甲基化。最后作者进行Dicer的细胞功能实验验证其对肿瘤进程的作用。

三、核心FIGURE

Figure1说明的是肿瘤细胞Dicer特异表达然后进入细胞核与核内的HP1α蛋白复合物互作。

A、 免疫组化检测正常组织细胞和肿瘤细胞的Dicer，表明肿瘤细胞的Dicer表达量升高并且转移到细胞核中。

B、 核质分离检测正常组织细胞系HIBEpic和肿瘤细胞系Hucct1、TFK1中的Dicer，表明肿瘤细胞的Dicer表达量升高并且细胞核含量比细胞质含量高。

C、 GST-pulldown，分别表达纯化GST-HP1α和GST-Dicer融合蛋白与细胞蛋白提取液孵育后用GST抗体钓取与标签蛋白结合的蛋白，然后进行WB验证，表明HP1α和Dicer有互作。

D、 Co-IP，分别用HP1α和Dicer从HIBEpic和Hucct1细胞中钓取与蛋白结合的蛋白进行WB验证，表明HP1α和Dicer有互作。

E、 Co-IP，用HP1α抗体钓取细胞中与HP1α结合的蛋白，然后进行WB验证，表明DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、SUV39H1、H3K9me3与HP1α有互作。

Figure2说明的是Dicer调节胆管癌细胞的染色体修饰。

A、q-pcr检测Dicer敲低慢病毒转染后细胞系中Dicer Mrna的表达。

B-C、WB分别检测Dicer敲低慢病毒转染细胞质和细胞核中的Dicer含量，表明肿瘤细胞系的Dicer表达量总是高于正常组织细胞系表达量，并且细胞核含量高于细胞质。

D、WB检测Dicer敲低慢病毒转染细胞的H3K9me3，表明肿瘤细胞Dicer敲低后组蛋白甲基化水平降低，而正常细胞系不受影响。

Figure3说明的是Dicer促进胆管癌细胞的SFRP1启动子CpG岛甲基化抑制SFRP1的表达。

A、 通过Dicer敲低慢病毒转染细胞后检测几种基因的甲基化水平。

B、 SFRP1启动子CpG岛以及进行CHIP和重亚硫酸盐PCR的示意图。

C、 CHIP实验，检测Dicer、HP1α、H3K9me3与SFRP1启动子的结合。

D、 重亚硫酸盐PCR检测SFRP1启动子DNA甲基化水平，表明肿瘤细胞DNA甲基化水平很高，Dicer敲低后DNA甲基化水平显著降低，而正常细胞系的甲基化水平很低，Dicer敲低后不影响DNA的甲基化。

E、 甲基转移酶抑制剂处理和Dicer敲低后检测SFRP1的mRNA，表明启动子甲基化影响基因的转录。

本公司可提供的技术服务项目

本公司可进行类似实验的实验设计及整体实验外包项目，包括WB、慢病毒稳转株的建立（过表达/敲低）、核质分离、Q-PCR、GST pull-down、co-IP、CHIP，其中GST pull-down、co-IP、CHIP为本公司主营项目。

一、GST pull-down：验证蛋白与蛋白互作的重要手段。

利用GST融合蛋白沉降技术，将靶蛋白与GST标签蛋白在细菌体内进行融合表达，纯化获取融合表达蛋白，与细胞蛋白提取液孵育，然后用标签抗体钓取蛋白-蛋白复合物，复合物进行WB验证。本实验表明HP1α和Dicer有互作。

二、 CO-IP：确定两种或多种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

本实验用HP1α抗体钓取细胞内与HP1α蛋白结合的蛋白质，产物用相应目的蛋白抗体进行WB验证，表明了细胞内HP1α与DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、SUV39H1、H3K9me3有互作。

三、 CHIP：主要研究蛋白与基因启动子之间的关系。

利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。后解交联，联用Q-PCR检测。本实验分别用HP1α、Dicer、H3k9me3抗体钓取与之结合的DNA片段，然后进行q-pcr检测表明这些蛋白与SFRP1启动子结合。

参考文献：Wenlong Cheng,Yongqiang Qi,Li Tian,et al. Dicer promotes tumorigenesis by translocating to nucleus to promote SFRP1 promoter methylation in cholangiocarcinoma cells[J]. Cell Death and Disease,2017,8,e2628