DNA甲基化研究案例（二）

一、调控通路

当DNMT（甲基转移酶）抑制剂消耗完时，DNMT结合到靶标基因miR-137的启动子上对启动子DNA进行甲基化修饰从而抑制miR-137表达；当DNMT抑制剂存在时，DNMT不能结合到靶标基因miR-137的启动子上从而使miR-137顺利表达，而miR-137会结合到ASCT2 Mrna的3’-UTR抑制其翻译为蛋白质；ASCT2是谷氨酰胺代谢过程的关键酶，ASCT2的表达促进谷氨酰胺的代谢。

二、实验流程

本文中作者分为两个部分进行阐述：miR-137作用于ASCT2 mRNA的3’-UTR抑制ASCT的表达，从而使谷氨酸代谢减弱；甲基化酶结合到miR-137启动子上促进DNA甲基化抑制miR-137的表达。（1）作者首先通过三种方法预测以ASCT2为靶标的microRNA，建立miR-137和miR-122过表达细胞株检测ASCT的表达表明miR-137和miR-122过表达使ASCT2表达降低，然后用WB检测其他microRNA过表达后的ASCT2的表达表明处理miR-137和miR-122外其他microRNA均不影响ASCT表达，于是作者又通过对不同细胞系进行miR-137过表达后检测ASCT2的表达进一步验证miR-137对ASCT2表达的抑制；为了验证miR-137对ASCT2的抑制机制，作者通过3’-UTR荧光素酶实验验证miR-137与ASCT2 3’-UTR结合从而抑制蛋白表达；作者通过对ASCT2敲低、miR-137敲低和抑制后细胞谷氨酰胺代谢的检测验证miR-7通过抑制ASCT表达来抑制谷氨酰胺的代谢。（2）作者用CHIP实验技术验证了甲基转移酶MECP2、DNMT1和DNMT3B与miR-137启动子上的CpG岛结合使其甲基化抑制miR-137的表达，然后检测MeCP2敲低或5-Aza-CdR处理后的细胞的miR-137的表达和谷氨酰胺的代谢。

三、核心FIGURE

Figure1说明的是miR-137作用于ASCT2 Mrna的3’-UTR抑制ASCT2的表达，降低谷氨酸代谢。

A、 不同方法预测以ASCT2作为靶标的microRNA。

B、 对miR-137、miR-122过表达后细胞检测ASCT2的表达，表明miR-137和miR-122过表达使ASCT2的表达降低。

C、 对一系列的microRNA过表达，然后用WB检测ASCT2的表达，表明只有MiR-137和miR-122过表达后使ASCT2表达下降。

D、 MiR-137与ASCT2 Mrna 3’-UTR结合位点预测。

E-F、分别用Q-PCR和WB检测不同细胞系miR-137过表达后ASCT2的表达，表明miR-137过表达使细胞的ASCT2表达降低

G、荧光素酶实验，检测miR-137与ASCT2 3’-URT的关系。

H、ASCT2敲低或miR-137过表达后检测谷氨酰胺的消耗。

I、对miR-137抑制后检测谷氨酰胺的代谢活性，表明miR-137抑制后，谷氨酰胺代谢增强。

Figure2说明的是甲基化酶MeCP2、DNMT1、DNMT3B结合到miR-137启动子CpG岛使DNA甲基化，抑制miR-137的表达，从而降低谷氨酸代谢。

A、 CHIP实验，分别用MeCP2、DNMT1和DNMT3B抗体钓取细胞中与蛋白结合的DNA片段，然后进行q-pcr验证，表明这几种蛋白结合到miR-137启动子的CpG岛。

B、 对MeCP2敲低后检测miR-137表达，表明MeCP2抑制miR-137的表达。

C、 对MeCP2敲低后检测ASCT2的表达，表明MeCP2促进ASCT2的表达。

D-E、用甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR处理细胞后检测miR-137和ASCT2的表达，表明5-Aza-CdR使miR-137表达升高而使ASCT2表达降低。

F-G、MeCP2敲低或用甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR处理细胞后检测谷氨酰胺代谢，表明MeCP2降低后谷氨酰胺代谢降低。

本公司可提供的技术服务

本公司可进行以上类似实验的实验设计及整体实验外包项目，包括Q-PCR、Western Blot、Luciferase检测、CHIP、慢病毒稳转株的建立（过表达/敲低），其中的Luciferase检测、CHIP为本公司主营项目。

一、 Luciferase检测：验证microRNA与靶标3’-UTR的互作。

将ASCT2 3’-UTR序列构建至载体中报告基因luciferase的后面，通过过表达miR-137检测荧光素酶活性，说明了miR-137作用于ASCT2 3’-UTR抑制基因表达。

二、CHIP技术：主要研究蛋白与基因启动子之间的关系。

利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。后解交联，联用Q-PCR检测。本实验分别用MeCP2、DNMT1和DNMT3B抗体钓取细胞中与蛋白结合的DNA片段，然后进行q-pcr检测，表明MeCP2、DNMT1和DNMT3B与miR-137启动子的CpG岛结合。

参考文献：J Dong,D Xiao,Z Zhao,et al.Epigenetic silencing of microRNA-137 enhances ASCT2 expression and tumor glutamine metabolism. Oncogenesis,2017,6,e356