ceRNA研究案例（一）

（一）调控通路：

在细胞的自我更新过程中，转录因子nanog、sox2和oct4促进Lnc-ROR的表达，之后Lnc-ROR作为miR-145的内源性海绵吸附体，促进转录因子nanog、sox2和oct4的表达。

（二）实验流程：

作者首先使用RNA FISH实验技术检测未分化和分化细胞中的LncROR的表达和分布说明LncROR与细胞分化有关，然后研究LncROR的调控机制。作者用WB实验检测ROR过表达/敲低后的OCT4等蛋白的表达来说明LncROR对蛋白表达的影响，然后通过荧光素酶实验检测miR-145与OCT4等mRNA的关系和miR-145与ROR的关系。Q-pcr检测ROR敲低后的miR-145前体和成熟体的表达说明ROR对miR-145表达的影响，随后对miR-145、LncROR敲低检测OCT4等的表达验证RNA对靶标的影响。此外，作者通过检测OCT4等敲低检测LncROR的表达和CHIP实验来说明OCT4等蛋白促进LncROR表达。

（三）核心FIGURE：

Figure2说明的是LncRNA ROR通过与miRNA的海绵吸附作用，促进OCT4、Nanog、SOX2的表达。

A、 先用Q-PCR分别检测OCT4和Nanog敲低后的LncROR的表达，然后用CHIP实验检测与OCT4、Nanog、SOX2结合的DNA片段，结果表明OCT4、Nanog、SOX2结合到LncROR启动子上促进LncROR的表达。

B、 分别Q-PCR和WB检测LncROR过表达和敲低后的OCT4、Nanog、SOX2的表达，结果表明LncROR与OCT4、Nanog、SOX2的表达正相关。

C、 miRNA与OCT4、Nanog、SOX2以及LncROR结合能力的检测，以miR-16-5b为阴性对照，结果表明几种miRNA与OCT4、Nanog、SOX2、LncROR的结合能力很高。

D、 荧光素酶活性检测miRNA与OCT4、Nanog、SOX2、LncROR的关系，结果表明miRNA抑制OCT4、Nanog、SOX2、LncROR的表达活性。

E、 荧光素酶活性检测miR-145结合LncROR结合的位点。

F、 荧光素酶活性检测LncROR诱导的OCT4等基因的3’-UTR与miR-145的关系，结果表明miR-145抑制蛋白的表达，而LncROR会降低miR-145的抑制作用。

  G-H、Q-pcr检测miR-145初始转录本、miR-145前体和成熟miR-145的表达水平，结果表明LncROR影响miR-145的表达。

  I、通过miR-145和LncROR的敲低检测OCT4、Nanog、SOX2，结果表明miR-145负调控OCT4、Nanog、SOX2，LncROR正调控OCT4、Nanog、SOX2。

  J、蛋白FISH，在细胞水平上直观检测LncROR敲低后的下游靶标蛋白的表达。

                  本公司可提供的技术服务

本公司可进行以上类似实验的实验设计及整体实验外包项目，包括q-pcr、WB、慢病毒稳转株的建立（过表达/敲低）、luciferase Assay、CHIP、，其中CHIP、luciferase Assay为本公司主营项目。

一、CHIP实验技术：CHIP实验主要研究蛋白与DNA之间的关系

用目的基因蛋白抗体钓取与之结合的DNA片段，然后用Lnc-ROR启动子区引物进行q-pcr检测基因启动子区的结合蛋白。本实验说明在细胞自我更新中OCT4、Nanog、SOX2结合到Lnc-ROR启动子上。

二、荧光素酶活性实验（luciferase Assay）：检测microRNA与靶标基因3'-UTR的关系。

通过构建miR-145表达质粒和靶标基因3’-UTR荧光素酶报告质粒双转染细胞株，用LncROR诱导检测荧光素酶活性，结果明了miR-145抑制蛋白的表达，而LncROR会降低miR-145的抑制作用。

三、FISH技术：免疫荧光原位杂交，对细胞中的核酸和蛋白进行定性、定位和定量。

分别用几种蛋白的抗体在细胞水平上直观检测LncROR敲低后的下游靶标蛋白的表达，从FISH结果我们可以直观的看出LncROR敲低后，其下游靶标的蛋白表达量明显增加。我公司在实验体系中设置阴性和阳性对照。

参考文献: Yue Wang, Zhenyu Xu, Junfeng Jiang,et al. Endogenous miRNA Sponge lincRNA-RoR Regulates Oct4, Nanog, and Sox2

in Human Embryonic Stem Cell Self-Renewal［J］. Developmental Cell，2013， 25, 69–80