Long noncoding RNA BC032469, a novel competing endogenous RNA, upregulates hTERT expression by sponging mi R-1207-5p and promotes proliferation in gastric cancer

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一种新的内源性RNA  lncRNA BC032469通过作为miR-1207-5p

的海绵吸附体促进hTERT的表达,促进胃癌细胞的增殖


一、 调控通路

实验流程和调控通路.jpg

当LncRNA BC032469低表达时,miR-1207结合到hTERT mRNA的3’-URT抑制mRNA翻译表达蛋白,当LncRNA BC032469高表达时,LncRNA BC032467作为miR-1207的海绵吸附体解除其对hTERT mRNA翻译的抑制,从而促进hTERT蛋白的表达。

 

二、 实验流程


ceRNA机制研究案例(六).jpg


作者首先对临床样本的胃癌组织和癌旁组织进行免疫组合检测hTERT的表达,hTERT在胃癌细胞中高表达,然后用LncRNA微阵列分析筛选出差异表达的lncRNA BC032469,再统计临床上胃癌病人的存活率与BC032469表达的关系。作者对LncRNA BC032469的研究分为两方面:功能和机制的研究。(1)功能实验:先建立LncRNA敲低稳定株,然后通过MTT、克隆形成、流式细胞仪、小鼠体内成瘤成瘤实验检测LncRNA的细胞增殖的作用,另外作者通过免疫组化检测hTERT的表达说明LncRNA对hTERT表达的影响。(2)机制实验:作者先用WB实验检测LncRNA敲低后的hTERT的表达表明LncRNA对hTERT表达有影响,然后通过荧光素酶实验验证LNcRNA并不影响hTERT启动的活性,表明LncRNA对HTERT表达的影响不是在转录水平上的。随后作者对LncRNA敲低后的microRNA表达谱分析筛选出表达差异的miR-1207,然后通过荧光素酶实验验证hTERT 3’-urt与miR-1207和LncRNA的关系,表明LncRNA通过与miR-1207结合解除miR-1207对mRNA表达的抑制。另外,作者用斑点印迹法检测miR-1207与hTERT 3’-UTR和LncRNA的结合。作者在最后通过RNA-FISH的方法在细胞内验证LncRNA与miR-1207的结合。


 

一、核心FIGURE

1.png

Figure1说明的是LncRNA敲低后hTERT表达降低,但不影响启动子活性,同时miR-1207-5p表达升高。

A、          WB检测LncRNA敲低后hTERT蛋白的表达,表明LncRNA敲低后hTERT表达降低。

B、           荧光素酶实验检测LncRNAhTERT基因启动子活性的影响,表明LncRNA不影响启动子活性。

C、           LncRNAmicroRNA的结合位点预测。

D、          LNcRNA敲低后检测microRNA的表达,筛选出差异表达miR-1207


10.jpg

Figure2说明的是LncRNA通过作为miR-1207的海绵吸附体促进Htert的表达。

A、          荧光素酶实验,通过LncRNA敲低,加入miR-1207的反向互补RNAHtert 3’-UTRmiR-1207结合位点突变检测荧光素酶活性,表明了LncRNA通过与miR-1207结合调控Htert 3’-UTR。后图是用miR-1266作为对照组。

B、           通过LncRNA敲低,加入miR-1207的反向互补RNAmiR-1266反向互补RNA后检测Htert的表达,表明了LncRNA通过与miR-1207结合促进Htert的表达。

C、           斑点印迹法检测miR-1207hTERT 3-UTRLncRNA的结合。

D、          RNA –FISH,用miR-1207-5pLncRNA探针进行免疫荧光原位杂交,对细胞内的miR-1207-5pLncRNA定位表明两者出现在细胞的同一位置。

 


本公司可提供的技术服务项目

本公司可进行类似实验的实验设计及整体实验外包项目,包括WB、慢病毒稳转株的建立(过表达/敲低)、Q-PCR、荧光素酶(Luciferase)实验、RNA-FISH,其中荧光素酶(Luciferase)实验、RNA-FISH为本公司主营项目。


一、荧光素酶(Luciferase)实验:检测LncRNAmicroRNA与靶标基因3’-UTR的关系。

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本实验作者通过LncRNA敲低,加入miR-1207的反向互补RNA和Htert 3’-UTR的miR-1207结合位点突变检测荧光素酶活性。结果表明了LncRNA敲低与Htert 3’-UTR组的荧光素酶活性显著下降,添加miR-1207的反向互补序列去结合miR-1207后荧光素酶活性显著增强;Htert 3’-URT的1207结合位点突变与LncRNA敲低组的荧光素酶活性无明显变化。表明LncRNA通过与miR-1207竞争性结合,释放Htert 3’-UTR,促进蛋白表达。

 


二、RNA-FISH荧光原位杂交,细胞中RNA的RNA表达的定性、定位或定量分析。


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本实验作者用RNA-FISH对细胞内的miR-1207和LncRNA两种RNA进行共定位,验证了miR-1207和LncRNA。我公司在实验体系中设置阴性和阳性对照。

 


参考文献:M-H Lü, B Tang,S Zeng,et al. Long noncoding RNA BC032469, a novel competing endogenousRNA, upregulates hTERT expression by sponging miR-1207-5p and promotes proliferation in gastric cancer[J]. Oncogene,2015, 1 – 11



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