一种新的内源性RNA  lncRNA BC032469通过作为miR-1207-5p

的海绵吸附体促进hTERT的表达，促进胃癌细胞的增殖

一、 调控通路

当LncRNA BC032469低表达时，miR-1207结合到hTERT mRNA的3’-URT抑制mRNA翻译表达蛋白，当LncRNA BC032469高表达时，LncRNA BC032467作为miR-1207的海绵吸附体解除其对hTERT mRNA翻译的抑制，从而促进hTERT蛋白的表达。

二、 实验流程

作者首先对临床样本的胃癌组织和癌旁组织进行免疫组合检测hTERT的表达，hTERT在胃癌细胞中高表达，然后用LncRNA微阵列分析筛选出差异表达的lncRNA BC032469，再统计临床上胃癌病人的存活率与BC032469表达的关系。作者对LncRNA BC032469的研究分为两方面：功能和机制的研究。（1）功能实验：先建立LncRNA敲低稳定株，然后通过MTT、克隆形成、流式细胞仪、小鼠体内成瘤成瘤实验检测LncRNA的细胞增殖的作用，另外作者通过免疫组化检测hTERT的表达说明LncRNA对hTERT表达的影响。（2）机制实验：作者先用WB实验检测LncRNA敲低后的hTERT的表达表明LncRNA对hTERT表达有影响，然后通过荧光素酶实验验证LNcRNA并不影响hTERT启动的活性，表明LncRNA对HTERT表达的影响不是在转录水平上的。随后作者对LncRNA敲低后的microRNA表达谱分析筛选出表达差异的miR-1207，然后通过荧光素酶实验验证hTERT 3’-urt与miR-1207和LncRNA的关系，表明LncRNA通过与miR-1207结合解除miR-1207对mRNA表达的抑制。另外，作者用斑点印迹法检测miR-1207与hTERT 3’-UTR和LncRNA的结合。作者在最后通过RNA-FISH的方法在细胞内验证LncRNA与miR-1207的结合。

一、核心FIGURE

Figure1说明的是LncRNA敲低后hTERT表达降低，但不影响启动子活性，同时miR-1207-5p表达升高。

A、          WB检测LncRNA敲低后hTERT蛋白的表达，表明LncRNA敲低后hTERT表达降低。

B、           荧光素酶实验检测LncRNA与hTERT基因启动子活性的影响，表明LncRNA不影响启动子活性。

C、           LncRNA与microRNA的结合位点预测。

D、          LNcRNA敲低后检测microRNA的表达，筛选出差异表达miR-1207。

Figure2说明的是LncRNA通过作为miR-1207的海绵吸附体促进Htert的表达。

A、          荧光素酶实验，通过LncRNA敲低，加入miR-1207的反向互补RNA和Htert 3’-UTR的miR-1207结合位点突变检测荧光素酶活性，表明了LncRNA通过与miR-1207结合调控Htert 3’-UTR。后图是用miR-1266作为对照组。

B、           通过LncRNA敲低，加入miR-1207的反向互补RNA、miR-1266反向互补RNA后检测Htert的表达，表明了LncRNA通过与miR-1207结合促进Htert的表达。

C、           斑点印迹法检测miR-1207与hTERT 3’-UTR和LncRNA的结合。

D、          RNA –FISH，用miR-1207-5p和LncRNA探针进行免疫荧光原位杂交，对细胞内的miR-1207-5p和LncRNA定位表明两者出现在细胞的同一位置。

本公司可提供的技术服务项目

本公司可进行类似实验的实验设计及整体实验外包项目，包括WB、慢病毒稳转株的建立（过表达/敲低）、Q-PCR、荧光素酶（Luciferase）实验、RNA-FISH，其中荧光素酶（Luciferase）实验、RNA-FISH为本公司主营项目。

一、荧光素酶（Luciferase）实验：检测LncRNA、microRNA与靶标基因3’-UTR的关系。

本实验作者通过LncRNA敲低，加入miR-1207的反向互补RNA和Htert 3’-UTR的miR-1207结合位点突变检测荧光素酶活性。结果表明了LncRNA敲低与Htert 3’-UTR组的荧光素酶活性显著下降，添加miR-1207的反向互补序列去结合miR-1207后荧光素酶活性显著增强；Htert 3’-URT的1207结合位点突变与LncRNA敲低组的荧光素酶活性无明显变化。表明LncRNA通过与miR-1207竞争性结合，释放Htert 3’-UTR，促进蛋白表达。

二、RNA-FISH：荧光原位杂交，细胞中RNA的RNA表达的定性、定位或定量分析。

本实验作者用RNA-FISH对细胞内的miR-1207和LncRNA两种RNA进行共定位，验证了miR-1207和LncRNA。我公司在实验体系中设置阴性和阳性对照。

参考文献：M-H Lü, B Tang,S Zeng,et al. Long noncoding RNA BC032469, a novel competing endogenousRNA, upregulates hTERT expression by sponging miR-1207-5p and promotes proliferation in gastric cancer［J］. Oncogene,2015, 1 – 11