The Imprinted H19 LncRNA Antagonizes Let-7 MicroRNAs

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LncRNA CeRNA机制研究案例(三)



(一)调控通路:


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LncRNA H19低表达时microRNA Let-7结合ago2mRNA3’-UTR抑制蛋白表达,当LncRNA H19高表达时LncRNA H19microRNA Let-7,促进mRNA翻译表达蛋白。




(二)实验流程:


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作者首先用生物信息学分析预测了LncRNA H19与Let-7的结合位点,然后进行荧光素酶实验验证H19与Let-7的结合。Ago2-RIP实验获得与ago2蛋白结合的RNA后进行Q-PCR检测验证了H19和Let-7都与ago2结合。随后,通过H19过表达/敲低,Let-7敲低检测下游靶标的表达,然后再一次进行荧光素酶实验验证H19与Let-7结合。最后检测H19和Let-7对细胞分化的影响。



(三)核心FIGURE:


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Figure1 说明的是H19Let-7相互结合。

ALet-7受体的荧光素酶报告质粒构建策略。

B、荧光素酶活性检测,分别将Let-7受体和H19荧光素酶报告质粒与let-7转染细胞,检测荧光素酶活性,结果表明H19Let-7结合。

C、荧光素酶活性检测,将Let-7受体荧光素酶报告质粒和H19表达质粒共转染细胞,检测荧光素酶活性,结果表明H19Let-7受体竞争结合Let-7

D、 Ago2-RIP,用ago2抗体钓取与蛋白结合的RNA,然后进行q-pcr检测,结果表明H19能与ago2结合。

E、Ago2-RIP,用ago2抗体钓取与蛋白结合的RNA,然后进行q-pcr检测,结果表明H19Let-7ago2结合。



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Figure2说明的是H19作为Let-7的海绵吸附体促进下游靶标基因的表达。

A、 H19过表达之后,分别用q-pcrWB检测下游靶标的Mrna和蛋白的表达以及Let-7的表达,结果表明H19过表达不影响mRNALet-7的表达,而蛋白的表达量升高。

B、 Let-7敲低后分别用q-pcrWB检测下游靶标的mRNA和蛋白的表达,结果表明Let-7敲低不影响mRNA的表达,而蛋白的表达量升高。

C、 H19敲低后分别用q-pcrWB检测下游靶标的mRNA和蛋白的表达,结果表明Let-7敲低不影响mRNA的表达,而蛋白的表达量升高。




本公司可提供的技术服务


本公司可进行以上类似实验的实验设计及整体实验外包项目,包括Q-PCRWestern BlotLuciferase检测、慢病毒稳转株的建立(过表达/敲低)、ago2-RIP,其中的Luciferase检测RIPago2-RIP为本公司主营项目。

 

  一、  Luciferase检测:检测mRNA的3-UTR或LncRNA与microRNA的关系。

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本实验检测的是LncRNAmicroRNA的关系,分别将Let-7受体和H19荧光素酶报告质粒与let-7转染细胞,检测荧光素酶活性,结果表明H19Let-7结合。Let-7受体作为对照。

 


二、Ago2-RIP主要研究ago2蛋白与RNA的相互作用

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本实验是用ago2蛋白抗体钓取与ago2结合的RNA,然后进行q-pcr检测表明ago2H19结合。我公司在实验体系中设置阳性及阴性对照,进一步排除系统误差。

 

参考文献:Amanda N. Kallen, Xiao-Bo Zhou, Jie Xu,et al. The Imprinted H19 LncRNA Antagonizes Let-7 MicroRNAs[J]. Molecular Cell,2013, 52, 101–112










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