LncRNA 的CeRNA机制研究案例（三）

（一）调控通路：

当LncRNA H19低表达时microRNA Let-7结合ago2到mRNA的3’-UTR抑制蛋白表达，当LncRNA H19高表达时LncRNA H19与microRNA Let-7，促进mRNA翻译表达蛋白。

（二）实验流程：

作者首先用生物信息学分析预测了LncRNA H19与Let-7的结合位点，然后进行荧光素酶实验验证H19与Let-7的结合。Ago2-RIP实验获得与ago2蛋白结合的RNA后进行Q-PCR检测验证了H19和Let-7都与ago2结合。随后，通过H19过表达/敲低，Let-7敲低检测下游靶标的表达，然后再一次进行荧光素酶实验验证H19与Let-7结合。最后检测H19和Let-7对细胞分化的影响。

（三）核心FIGURE：

Figure1 说明的是H19与Let-7相互结合。

A、Let-7受体的荧光素酶报告质粒构建策略。

B、荧光素酶活性检测，分别将Let-7受体和H19荧光素酶报告质粒与let-7转染细胞，检测荧光素酶活性，结果表明H19与Let-7结合。

C、荧光素酶活性检测，将Let-7受体荧光素酶报告质粒和H19表达质粒共转染细胞，检测荧光素酶活性，结果表明H19与Let-7受体竞争结合Let-7。

D、 Ago2-RIP，用ago2抗体钓取与蛋白结合的RNA，然后进行q-pcr检测，结果表明H19能与ago2结合。

E、Ago2-RIP，用ago2抗体钓取与蛋白结合的RNA，然后进行q-pcr检测，结果表明H19、Let-7与ago2结合。

Figure2说明的是H19作为Let-7的海绵吸附体促进下游靶标基因的表达。

A、 H19过表达之后，分别用q-pcr和WB检测下游靶标的Mrna和蛋白的表达以及Let-7的表达，结果表明H19过表达不影响mRNA和Let-7的表达，而蛋白的表达量升高。

B、 Let-7敲低后分别用q-pcr和WB检测下游靶标的mRNA和蛋白的表达，结果表明Let-7敲低不影响mRNA的表达，而蛋白的表达量升高。

C、 H19敲低后分别用q-pcr和WB检测下游靶标的mRNA和蛋白的表达，结果表明Let-7敲低不影响mRNA的表达，而蛋白的表达量升高。

本公司可提供的技术服务

本公司可进行以上类似实验的实验设计及整体实验外包项目，包括Q-PCR、Western Blot、Luciferase检测、慢病毒稳转株的建立（过表达/敲低）、ago2-RIP，其中的Luciferase检测、RIP、ago2-RIP为本公司主营项目。

  一、  Luciferase检测：检测mRNA的3’-UTR或LncRNA与microRNA的关系。

本实验检测的是LncRNA与microRNA的关系，分别将Let-7受体和H19荧光素酶报告质粒与let-7转染细胞，检测荧光素酶活性，结果表明H19与Let-7结合。Let-7受体作为对照。

二、Ago2-RIP：主要研究ago2蛋白与RNA的相互作用

本实验是用ago2蛋白抗体钓取与ago2结合的RNA，然后进行q-pcr检测表明ago2与H19结合。我公司在实验体系中设置阳性及阴性对照，进一步排除系统误差。

参考文献：Amanda N. Kallen, Xiao-Bo Zhou, Jie Xu,et al. The Imprinted H19 LncRNA Antagonizes Let-7 MicroRNAs［J］. Molecular Cell,2013, 52, 101–112