ceRNA机制研究案例（四）

一、调控通路：

LncRNA MD1上有一段miR-133的前体序列。在细胞分化前，HuR蛋白结合到Lnc-MD1上抑制Lnc-MD1的剪切断裂，Lnc-MD1作为miR-133的海绵吸附体使miR-133前体序列结合miR-133，解除miR-133对HuR Mrna翻译的抑制促进HuR的表达。在细胞分化时，Lnc-MD1断裂释放miR-133前体使miR-133表达升高，miR-133结合到HuR mRNA的3’-UTR上抑制HuR的表达从而使得Lnc-MD1又可作为miR-133的前体。

二、 实验流程：

作者首先进行荧光素酶实验检测HuR与Lnc-MD1的关系以及对Lnc-MD1过表达和敲低后检测HuR的表达，表明LncMD1对HuR的促进作用。随后分别用RIP和RNA pull-down来验证Lnc-MD1与HuR、Ago2的结合，用RNA-RNA pull-down验证Lnc-MD1与miR-133结合。然后通过EMSA实验验证HuR与Lnc-MD1并验证了与Lnc-MD1的结合位点说HuR结合到Lnc-MD1上的miR-133前体序列上。最后作者通过检测细胞分化过程中的Lnc-MD1、miR-133和HuR的表达，以及检测HuR敲低后的Lnc-MD1的表达，表明HuR抑制Lnc-MD1转变为miR-133。

三、核心FIGURE：

Figure1说明的是Lnc-MD1对HuR蛋白表达的影响。

A-C、荧光素酶实验，将HuR mRNA3’-UTR连接到荧光素酶报告质粒上与Lnc-MD1表达质粒共转染后检测细胞的荧光素酶活性。

E、 Q-PCR检测Lnc-MD1过表达/敲低，WB检测Lnc-MD1过表达/敲低后HuR蛋白的表达。表明Lnc-MD1促进HuR的表达。

Figure2说明的是HuR与Lnc-MD1结合后，Lnc-MD1作为miR-133的吸附体结合miR-133。

A、 RIP实验，用HuR蛋白抗体从小鼠和人的细胞中钓取与HuR结合的RNA，然后进行Q-PCR检测，表明HuR与Lnc-MD1结合。

B、 Ago2-RIP，用Ago2抗体钓取与Ago2蛋白结合的RNA，然后然后进行Q-PCR检测，表明Ago2与Lnc-MD1结合。

C、 RNA pull-down/RNA-RNA pull-down，用Lnc-MD1探针钓取与之结合蛋白和RNA，产物进行WB和Q-PCR检测，表明Lnc-MD1能与HuR、Ago2蛋白结合，也与miR-133高度结合。

D、 EMSA实验，用Lnc-MD1探针与HuR进行体外结合实验，表明lnc-MD1包含miR-133序列区段与HuR结合。

E、 EMSA实验，用MD1-133b探针与冷探针进行体外结合HuR实验，表明两者具有竞争关系。

F、 EMSA实验，用MD1-133b探针、突变探针和HuR进行体外结合实验，突变后的MD1-133不与HuR结合。

Figure3说明的是HuR对Lnc-MD1和miR-133的影响。

A、 细胞分化过程中WB检测HuR，RT-PCR检测Lnc-MD1，NB检测miR-133的表达。表明在细胞分化中期（48-72h）HuR和Lnc-MD1表达升高，在分化后期HuR和Lnc-MD1表达下降，而pre-miR-133b和miR-133b的表达升高。

B、 Lnc-MD1作为miR-133前体的示意图。

C、 Q-pcr检测HuR敲低后Lnc-MD1、pre-miR-133b和miR-133b的表达，表明HuR敲低后，Lnc-MD1下降，pre-miR-133b和miR-133b升高。

本公司可提供的技术服务

本公司可进行以上类似实验的实验设计及整体实验外包项目，包括q-pcr、WB、慢病毒稳转株的建立（过表达/敲低）、luciferase Assay、RIP、Ago2-RIP、RNA pull-down、RNA-RNA pull-down、EMSA、Nortern blot，其中luciferase Assay、RIP、Ago2-RIP、RNA pull-down、RNA-RNA pull-down、EMSA为本公司主营项目。

一、   luciferase Assay：检测microRNA与靶标基因3’-UTR的关系。

将HuR mRNA上包含miR-133结合位点或miR-133结合位点缺失的3’-UTR连接到荧光素酶报告质粒上，然后与Lnc-MD1或Lnc-MD1上133结合位点缺失的表达质粒共转染后检测细胞的荧光素酶活性。

二、RIP/ago2-RIP实验：RIP(RNA 免疫共沉淀)技术主要研究蛋白与RNA的相互作用。

利用HuR抗体从小鼠细胞和人细胞裂解液中钓取与HuR蛋白结合的RNA，产物进行qrt-PCR检测，结果表明Lnc-MD1与HuR蛋白结合。我公司在实验体系中设置阳性及阴性对照，进一步排除系统误差。

Ago2-RIP，Ago2是一种与microRNA结合后调控Mrna翻译的蛋白，本实验利用Ago2-抗体钓取与ago2蛋白结合的RNA，产物进行Q-PCR检测，表明Lnc-MD1与Ago2结合。我公司在实验体系中设置阳性及阴性对照，进一步排除系统误差。

三、RNA pull-down：检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间相互作用的主要实验手段之一。

用Lnc-MD1探针钓取与RNA结合的蛋白，然后进行WB验证，表明Lnc-MD1结合Ago2和HuR。

四、 RNA-RNA pull-down：检测RNA与其靶RNA之间相互作用的主要实验手段。

用Lnc-MD1探针钓取与之结合的RNA，产物进行Q-PCR检测，结果表明miR-133与Lnc-MD1高度结合。

参考文献：Ivano Legnini, Mariangela Morlando, Arianna Mangiavacchi，et al. A Feedforward Regulatory Loop between HuR and the Long Noncoding RNA linc-MD1 Controls Early Phases of Myogenesis. Molecular Cell,2013, 53, 506–514