A Feedforward Regulatory Loop between HuR and the Long Noncoding RNA linc-MD1 Controls Early Phases of Myogenesis

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ceRNA机制研究案例(四)


一、调控通路:

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LncRNA MD1上有一段miR-133的前体序列。在细胞分化前,HuR蛋白结合到Lnc-MD1上抑制Lnc-MD1的剪切断裂,Lnc-MD1作为miR-133的海绵吸附体使miR-133前体序列结合miR-133,解除miR-133对HuR Mrna翻译的抑制促进HuR的表达。在细胞分化时,Lnc-MD1断裂释放miR-133前体使miR-133表达升高,miR-133结合到HuR mRNA的3’-UTR上抑制HuR的表达从而使得Lnc-MD1又可作为miR-133的前体。

 

二、 实验流程:

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作者首先进行荧光素酶实验检测HuR与Lnc-MD1的关系以及对Lnc-MD1过表达和敲低后检测HuR的表达,表明LncMD1对HuR的促进作用。随后分别用RIP和RNA pull-down来验证Lnc-MD1与HuR、Ago2的结合,用RNA-RNA pull-down验证Lnc-MD1与miR-133结合。然后通过EMSA实验验证HuR与Lnc-MD1并验证了与Lnc-MD1的结合位点说HuR结合到Lnc-MD1上的miR-133前体序列上。最后作者通过检测细胞分化过程中的Lnc-MD1、miR-133和HuR的表达,以及检测HuR敲低后的Lnc-MD1的表达,表明HuR抑制Lnc-MD1转变为miR-133。

 

三、核心FIGURE:

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Figure1说明的是Lnc-MD1对HuR蛋白表达的影响。

A-C、荧光素酶实验,将HuR mRNA3’-UTR连接到荧光素酶报告质粒上与Lnc-MD1表达质粒共转染后检测细胞的荧光素酶活性。

E、 Q-PCR检测Lnc-MD1过表达/敲低,WB检测Lnc-MD1过表达/敲低后HuR蛋白的表达。表明Lnc-MD1促进HuR的表达。


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Figure2说明的是HuR与Lnc-MD1结合后,Lnc-MD1作为miR-133的吸附体结合miR-133。

A、 RIP实验,用HuR蛋白抗体从小鼠和人的细胞中钓取与HuR结合的RNA,然后进行Q-PCR检测,表明HuR与Lnc-MD1结合。

B、 Ago2-RIP,用Ago2抗体钓取与Ago2蛋白结合的RNA,然后然后进行Q-PCR检测,表明Ago2与Lnc-MD1结合。

C、 RNA pull-down/RNA-RNA pull-down,用Lnc-MD1探针钓取与之结合蛋白和RNA,产物进行WB和Q-PCR检测,表明Lnc-MD1能与HuR、Ago2蛋白结合,也与miR-133高度结合。

D、 EMSA实验,用Lnc-MD1探针与HuR进行体外结合实验,表明lnc-MD1包含miR-133序列区段与HuR结合。

E、 EMSA实验,用MD1-133b探针与冷探针进行体外结合HuR实验,表明两者具有竞争关系。

F、 EMSA实验,用MD1-133b探针、突变探针和HuR进行体外结合实验,突变后的MD1-133不与HuR结合。



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Figure3说明的是HuR对Lnc-MD1和miR-133的影响。

A、 细胞分化过程中WB检测HuR,RT-PCR检测Lnc-MD1,NB检测miR-133的表达。表明在细胞分化中期(48-72h)HuR和Lnc-MD1表达升高,在分化后期HuR和Lnc-MD1表达下降,而pre-miR-133b和miR-133b的表达升高。

B、 Lnc-MD1作为miR-133前体的示意图。

C、 Q-pcr检测HuR敲低后Lnc-MD1、pre-miR-133b和miR-133b的表达,表明HuR敲低后,Lnc-MD1下降,pre-miR-133b和miR-133b升高。



 

本公司可提供的技术服务


本公司可进行以上类似实验的实验设计及整体实验外包项目,包括q-pcr、WB、慢病毒稳转株的建立(过表达/敲低)、luciferase Assay、RIP、Ago2-RIP、RNA pull-down、RNA-RNA pull-down、EMSA、Nortern blot,其中luciferase Assay、RIP、Ago2-RIP、RNA pull-down、RNA-RNA pull-down、EMSA为本公司主营项目。


一、   luciferase Assay:检测microRNA与靶标基因3’-UTR的关系。

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将HuR mRNA上包含miR-133结合位点或miR-133结合位点缺失的3’-UTR连接到荧光素酶报告质粒上,然后与Lnc-MD1或Lnc-MD1上133结合位点缺失的表达质粒共转染后检测细胞的荧光素酶活性。



二、RIP/ago2-RIP实验:RIP(RNA 免疫共沉淀)技术主要研究蛋白与RNA的相互作用。


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利用HuR抗体从小鼠细胞和人细胞裂解液中钓取与HuR蛋白结合的RNA,产物进行qrt-PCR检测,结果表明Lnc-MD1与HuR蛋白结合。我公司在实验体系中设置阳性及阴性对照,进一步排除系统误差。

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Ago2-RIP,Ago2是一种与microRNA结合后调控Mrna翻译的蛋白,本实验利用Ago2-抗体钓取与ago2蛋白结合的RNA,产物进行Q-PCR检测,表明Lnc-MD1与Ago2结合。我公司在实验体系中设置阳性及阴性对照,进一步排除系统误差。


三、RNA pull-down检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间相互作用的主要实验手段之一。

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用Lnc-MD1探针钓取与RNA结合的蛋白,然后进行WB验证,表明Lnc-MD1结合Ago2和HuR。


 

四、 RNA-RNA pull-down检测RNA与其靶RNA之间相互作用的主要实验手段。


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用Lnc-MD1探针钓取与之结合的RNA,产物进行Q-PCR检测,结果表明miR-133与Lnc-MD1高度结合。

 

参考文献:Ivano Legnini, Mariangela Morlando, Arianna Mangiavacchiet al. A Feedforward Regulatory Loop between HuR and the Long Noncoding RNA linc-MD1 Controls Early Phases of Myogenesis. Molecular Cell,2013, 53, 506–514

 








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