H3K27 acetylation activated-long non-coding RNA CCAT1 affects cell proliferation and migration by regulating SPRY4 and HOXB13 expression in esophageal squamous cell carcinoma

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ceRNA研究案例(二)

(一)调控通路图

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 在细胞核内,LncCCAT1将PRC2和SUV39H1结合到SPRY4启动子上促进启动子组蛋白甲基化,抑制SPRY4的表达;在细胞质中,LncCCAT1作为miR-7的内源性海绵吸附体结合miR-7使HOXB13 mRNA翻译不受miR-7-ago2抑制。



(二)实验流程:

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       1、LncRNA CCAT1筛选:作者首先通过食管鳞状细胞癌和癌旁组织的LncRNA芯片分析筛选出在食管鳞状细胞癌中高表达的LncRNA CCAT1,然后用QRT-PCR验证,并且用生物信息学分析预测与LncRNA CCAT1结合的靶标。

        2、LncRNA CCAT1功能实验:构建慢病毒过表达和敲低稳定转染细胞株,进行MTT、Brdu实验检测LncRNA CCAT1对细胞增殖的影响,另外向小鼠体内注射细胞检测细胞瘤形成情况。

        3、机制实验:机制实验分为两部分

         一是LncRNA CCAT1将EAH2和SUV39H结合到SPRY4的启动子上促进启动子组蛋白甲基化,抑制SPRY4基因的表达。作者首先进行RNA pull-down和RIP实验验证LncRNA CCAT1与EZH2和SUV39H结合,然后进行CHIP实验验证了EZH2和SUV39结合到SPRY4启动子上并促进组蛋白H3K9甲基化。最后通过对LncRNA CCAT1、EZH2、SUV39H的过表达/敲低后检测SPRY4的表达。

         二是LncRNA CCAT1作为miR-7的海绵吸附体结合miR-7,解除miR-7对HOXB13 mRNA翻译的抑制。首先通过启动子荧光素酶实验检测LncRNA CCAT1与HOXB13启动子的关系表明LncRNA CCAT1对HOXB13启动子活性无影响,然后检测LncRNA CCAT1过表达/敲低后的miR-7表达,miR-7 mimics的HOXB13的表达。之后进行HOXB13的3'-UTR荧光素酶检测表明miR-7对HOXB13的3'-UTR的作用。最后用RIP实验验证LncCCAT1与miR-7-ago2复合体结合。



(三)核心FIGURE:



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Figure1说明的是LncRNA CCAT1通过将EZH2和SUV39H1结合到SPRY4启动子上抑制SPRY4的表达,促进细胞增殖。

A、RNA pull-down,用LncRNA CCAT1探针钓取与之结合的蛋白,用EZH2和AUV39H1抗体进行WB检测,结果表明LncRNA CCAT1与EZH2和AUV39H1蛋白结合。

B、RIP实验,分别用蛋白抗体钓取与蛋白结合的RNA,结果表明LncRNA CCAT1与蛋白EZH1、AUV39H1结合。

C、CHIP实验,分别用SUV39H1和H3K9me3抗体钓取LncRNA CCAT1敲低和过表达细胞中的结合DNA片段,然后用SPRY4启动子引物进行Q-PCR检测,结果表明LncRNA CCAT1过表达细胞与敲低细胞相比,过表达细胞的SUV39H1结合到SPRY4启动子上并且使组蛋白甲基化程度明显增加。

D、LncRNA CCAT1的过表达和EZH2、SUV39H1的敲低后,用Q-PCR检测SPRY4的表达,结果表明只有LncRNA CCAT1过表达时SPRY4低表达,而同时过表达LncRNA CCAT1和敲低EZH2或SUV39H1时SPRY4高表达。

E、细胞活性检测,上图为SPRY4过表达的WB检测,下图为LncRNA CCAT1的过表达后抑制SPRY4对细胞增殖的促进作用。




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Figure2说明的是LncRNA CCAT1与miR-7结合下调miR-7,促进HOXB13 mRNA翻译表达。

A、 WB实验,检测LncRNA CCAT1敲低和过表达细胞的HOXB13表达情况,结果表明LncRNA CCAT1促进HOXB13的表达。

B、 荧光素酶检测LncRNA CCAT1与HOXB13启动子关系,表明LncRNA CCAT1对HOXB13启动子的转录活性无影响。

C、 Q-PCR检测LncRNA CCAT1敲低和过表达的miR-7的表达,结果表明LncRNA CCAT1敲低时miR-7高表达,LncRNA CCAT1过表达时miR-7低表达。说明LncRNA CCAT1可能是通过调控miR-7来调控HOXB13的表达。

D、 通过增强miRNA功能检测HOXB13的表达,结果说明miR-7抑制HOXB13的表达。

E、 荧光素酶检测LncCCAT1、miR-7和HOXB13 3'-UTR的关系,结果表明LncRNACCAT1、HOXB13 3'-UTR的荧光树酶活性均受miR-7下调。

F、 荧光素酶检测LncCCAT1和HOXB13 3'-UTR的关系。

G、 RIP实验,用ago2抗体钓取与ago2蛋白结合的RNA,q-pcr检测产物,表明LncCCAT1能结合miR-7-ago2复合体。

H、 检测LncCCAT1过表达、miR-7转染细胞中的HOXB13表达,表明miR-7下调HOXB13,而LncCCAT1抑制miR-7的下调作用。

I-J、细胞活性检测,表明LncCCAT1通过促进HOXB13表达来促进细胞的增殖和侵染。



我们公司可以提供的技术服务

本公司可进行以上类似实验的实验设计及整体实验外包项目,包括RIP、CHIP、慢病毒稳转株的建立(过表达/敲低)、WB、Q-PCR、荧光素酶实验、miRNA-mimics,其中RNA pull-down、RIP、CHIP、荧光素酶实验为本公司主营项目。


一、RNA pull-down:检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间相互作用的主要实验手段之一

            

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用Lnc CCAT1生物素标记探针钓取与RNA结合的蛋白,然后进行WB检测,表明了Lnc CCAT1结合EZH2和SUV39H1,并且EZH2结合在LncRNA的5’端,SUV39H1结合在3’端。


二、RIP实验:RIP(RNA 免疫共沉淀)技术主要研究蛋白与RNA的相互作用


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利用相应蛋白抗体,在全蛋白提取液中捕蛋白-RNA复合体,洗脱RNA,反转录,qPCR检测表明了LncCCAT1与SUV39H1、EZH2以及SUZ12高度结合。我公司在实验体系中设置阳性及阴性对照,进一步排除系统误差。


、 CHIP实验主要研究蛋白与基因启动子之间的关系。


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利用抗原抗体的特异性识别反应,将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。后解交联,联用Q-PCR检测。本实验分别用SUV39H1和H3K9me3抗体钓取DNA片段后用Q-PCR检测表明SPRY4的启动子结合SUV39H1和H3K9me3蛋白。


四、 萤光素酶活性实验(luciferase Assay)一类是检测转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合,一类是检测miRNA与靶基因3’UTR作用关系,通过不同的荧光素酶载体实现。

              

          例一:启动子荧光素酶实验

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该实验验证的是LncCCAT1与HOXB13启动子之间的关系,通过构建CCAT1的RNA干扰转染细胞株检测HOXB3启动子活性,以CCAT1非干扰为对照,表明了LncCCAT1对HOXB3启动子活性无影响。


         例二:3'-UTR荧光素酶实验

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本实验验证miR-7对HOXB13 3’-UTR作用调控基因表达,实验表明miR-7功能增强对靶基因的表达起下调作用,而3’-UTR突变后靶基因表达不受miR-7影响。

 

参考文献:Erbao Zhang , Liang Han, Dandan Yin,et al. H3K27 acetylation activated-long non-coding RNA CCAT1 affects cell proliferation and migration by regulating SPRY4 and HOXB13 expression in esophageal squamous cell carcinoma[J]. Nucleic Acids Research, 2016, 10.1093





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