ceRNA研究案例（二）

（一）调控通路图

 在细胞核内，LncCCAT1将PRC2和SUV39H1结合到SPRY4启动子上促进启动子组蛋白甲基化，抑制SPRY4的表达；在细胞质中，LncCCAT1作为miR-7的内源性海绵吸附体结合miR-7使HOXB13 mRNA翻译不受miR-7-ago2抑制。

（二）实验流程：

       1、LncRNA CCAT1筛选：作者首先通过食管鳞状细胞癌和癌旁组织的LncRNA芯片分析筛选出在食管鳞状细胞癌中高表达的LncRNA CCAT1，然后用QRT-PCR验证，并且用生物信息学分析预测与LncRNA CCAT1结合的靶标。

        2、LncRNA CCAT1功能实验：构建慢病毒过表达和敲低稳定转染细胞株，进行MTT、Brdu实验检测LncRNA CCAT1对细胞增殖的影响，另外向小鼠体内注射细胞检测细胞瘤形成情况。

        3、机制实验：机制实验分为两部分

         一是LncRNA CCAT1将EAH2和SUV39H结合到SPRY4的启动子上促进启动子组蛋白甲基化，抑制SPRY4基因的表达。作者首先进行RNA pull-down和RIP实验验证LncRNA CCAT1与EZH2和SUV39H结合，然后进行CHIP实验验证了EZH2和SUV39结合到SPRY4启动子上并促进组蛋白H3K9甲基化。最后通过对LncRNA CCAT1、EZH2、SUV39H的过表达/敲低后检测SPRY4的表达。

         二是LncRNA CCAT1作为miR-7的海绵吸附体结合miR-7，解除miR-7对HOXB13 mRNA翻译的抑制。首先通过启动子荧光素酶实验检测LncRNA CCAT1与HOXB13启动子的关系表明LncRNA CCAT1对HOXB13启动子活性无影响，然后检测LncRNA CCAT1过表达/敲低后的miR-7表达，miR-7 mimics的HOXB13的表达。之后进行HOXB13的3'-UTR荧光素酶检测表明miR-7对HOXB13的3'-UTR的作用。最后用RIP实验验证LncCCAT1与miR-7-ago2复合体结合。

（三）核心FIGURE：

Figure1说明的是LncRNA CCAT1通过将EZH2和SUV39H1结合到SPRY4启动子上抑制SPRY4的表达，促进细胞增殖。

A、RNA pull-down，用LncRNA CCAT1探针钓取与之结合的蛋白，用EZH2和AUV39H1抗体进行WB检测，结果表明LncRNA CCAT1与EZH2和AUV39H1蛋白结合。

B、RIP实验，分别用蛋白抗体钓取与蛋白结合的RNA，结果表明LncRNA CCAT1与蛋白EZH1、AUV39H1结合。

C、CHIP实验，分别用SUV39H1和H3K9me3抗体钓取LncRNA CCAT1敲低和过表达细胞中的结合DNA片段，然后用SPRY4启动子引物进行Q-PCR检测，结果表明LncRNA CCAT1过表达细胞与敲低细胞相比，过表达细胞的SUV39H1结合到SPRY4启动子上并且使组蛋白甲基化程度明显增加。

D、LncRNA CCAT1的过表达和EZH2、SUV39H1的敲低后，用Q-PCR检测SPRY4的表达，结果表明只有LncRNA CCAT1过表达时SPRY4低表达，而同时过表达LncRNA CCAT1和敲低EZH2或SUV39H1时SPRY4高表达。

E、细胞活性检测，上图为SPRY4过表达的WB检测，下图为LncRNA CCAT1的过表达后抑制SPRY4对细胞增殖的促进作用。

Figure2说明的是LncRNA CCAT1与miR-7结合下调miR-7，促进HOXB13 mRNA翻译表达。

A、 WB实验，检测LncRNA CCAT1敲低和过表达细胞的HOXB13表达情况，结果表明LncRNA CCAT1促进HOXB13的表达。

B、 荧光素酶检测LncRNA CCAT1与HOXB13启动子关系，表明LncRNA CCAT1对HOXB13启动子的转录活性无影响。

C、 Q-PCR检测LncRNA CCAT1敲低和过表达的miR-7的表达，结果表明LncRNA CCAT1敲低时miR-7高表达，LncRNA CCAT1过表达时miR-7低表达。说明LncRNA CCAT1可能是通过调控miR-7来调控HOXB13的表达。

D、 通过增强miRNA功能检测HOXB13的表达，结果说明miR-7抑制HOXB13的表达。

E、 荧光素酶检测LncCCAT1、miR-7和HOXB13 3'-UTR的关系，结果表明LncRNACCAT1、HOXB13 3'-UTR的荧光树酶活性均受miR-7下调。

F、 荧光素酶检测LncCCAT1和HOXB13 3'-UTR的关系。

G、 RIP实验，用ago2抗体钓取与ago2蛋白结合的RNA，q-pcr检测产物，表明LncCCAT1能结合miR-7-ago2复合体。

H、 检测LncCCAT1过表达、miR-7转染细胞中的HOXB13表达，表明miR-7下调HOXB13，而LncCCAT1抑制miR-7的下调作用。

I-J、细胞活性检测，表明LncCCAT1通过促进HOXB13表达来促进细胞的增殖和侵染。

我们公司可以提供的技术服务

本公司可进行以上类似实验的实验设计及整体实验外包项目，包括RIP、CHIP、慢病毒稳转株的建立（过表达/敲低）、WB、Q-PCR、荧光素酶实验、miRNA-mimics，其中RNA pull-down、RIP、CHIP、荧光素酶实验为本公司主营项目。

一、RNA pull-down：检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间相互作用的主要实验手段之一。

用Lnc CCAT1生物素标记探针钓取与RNA结合的蛋白，然后进行WB检测，表明了Lnc CCAT1结合EZH2和SUV39H1，并且EZH2结合在LncRNA的5’端，SUV39H1结合在3’端。

二、RIP实验：RIP(RNA 免疫共沉淀)技术主要研究蛋白与RNA的相互作用

利用相应蛋白抗体，在全蛋白提取液中捕蛋白-RNA复合体，洗脱RNA，反转录，qPCR检测表明了LncCCAT1与SUV39H1、EZH2以及SUZ12高度结合。我公司在实验体系中设置阳性及阴性对照，进一步排除系统误差。

三、 CHIP实验：主要研究蛋白与基因启动子之间的关系。

利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。后解交联，联用Q-PCR检测。本实验分别用SUV39H1和H3K9me3抗体钓取DNA片段后用Q-PCR检测表明SPRY4的启动子结合SUV39H1和H3K9me3蛋白。

四、 萤光素酶活性实验（luciferase Assay）：一类是检测转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合，一类是检测miRNA与靶基因3’UTR作用关系，通过不同的荧光素酶载体实现。

          例一：启动子荧光素酶实验

该实验验证的是LncCCAT1与HOXB13启动子之间的关系，通过构建CCAT1的RNA干扰转染细胞株检测HOXB3启动子活性，以CCAT1非干扰为对照，表明了LncCCAT1对HOXB3启动子活性无影响。

         例二：3'-UTR荧光素酶实验

本实验验证miR-7对HOXB13 3’-UTR作用调控基因表达，实验表明miR-7功能增强对靶基因的表达起下调作用，而3’-UTR突变后靶基因表达不受miR-7影响。

参考文献：Erbao Zhang , Liang Han, Dandan Yin，et al. H3K27 acetylation activated-long non-coding RNA CCAT1 affects cell proliferation and migration by regulating SPRY4 and HOXB13 expression in esophageal squamous cell carcinoma［J］. Nucleic Acids Research, 2016, 10.1093