转录调控-转录抑制研究案例（二）

（一）调控机制：

LncHOXA11-AS将转录因子TNMT1和EZH2结合到mir-200b的启动子上促进启动子组蛋白甲基化，抑制miR-200b的表达从而促进miR-200b靶标mRNAd的翻译。

（二）实验流程：

  作者首先通过Q-PCR检测非小细胞肺癌和癌旁组织细胞的LncRNA HOXA11-AS的表达筛选出LncRNA。对LncRNA HOXA11-AS的研究从功能和调控机制两方面进行。（1）HOXA11-AS功能实验，作者通过建立HOXA11-AS的过表达和敲低稳定细胞株，Transwell实验检测细胞的侵袭，以及用Q-PCR和WB检测癌进程相关基因的表达。（2）调控机制研究：首先通过RIP实验验证了LncRNA HOXA11-AS与转录因子EZH2和TNMT1结合，并用Q-PCR检测HOXA11-AS敲低后的miR-200b的表达升高，然后通过CHIP验证HOXA11-AS敲低后转录因子蛋白EZH2、TNMT1与miR-200b启动子的结合降低。最后作者通过HOXA11-AS和miR-200b抑制后进行WB检测miR-200b靶标mRNA蛋白的表达。

（三）核心FIGURE：

Figure1说明的是LncRNA HOXA11-AS通过与蛋白EZH2、DNMT1的作用抑制miR-200b的表达。

A、RIP实验，分别用EZH2和DNMT1抗体在A549和H1299细胞中钓取与蛋白结合的LncRNA ，QRT-PCR检测表明HOXA11-AS与蛋白EZH2、DNMT1结合

B、CHIP实验，用EZH2、DNMT1抗体钓取与蛋白结合的DNA片段，Q-PCR检测表明这两种蛋白与miR-200b启动子结合

C、CHIP实验，用EZH2、DNMT1抗体分别钓取si-HOXA11-AS细胞和si-NC细胞中与蛋白结合的DNA片段，然后Q-PCR检测表明si-HOXA11-AS敲低时蛋白与miR-200b启动子的结合下降

D、Q-PCR检测si-HOXA11-AS和si-EZH2的细胞miR-200b的表达情况，结果表明当LncRNA沉默或蛋白EZH2沉默时，miR-200b的表达上升。

Figure2说明的是LncRNA与EMT进程相关基因表达的关系。

A-B、QRT-PCR检测si-HOXA11-AS细胞和si-NC细胞中相关基因mRNA的表达，结果表明si-HOXA11-AS细胞促进EMT进程的基因表达下降。

C-D、Western Blot检测si-HOXA11-AS细胞和si-NC细胞中肿瘤相关基因的蛋白表达，与QRT-PCR结果一致。

E、Western Blot检测si-HOXA11-AS和si-HOXA11-AS+mir-200b抑制的相关蛋白表达，表明HOXA11-AS抑制mir-200b，促进相关蛋白的表达。

本公司可提供的技术服务项目

本公司可进行以上类似实验的实验设计及整体实验外包项目，包括CHIP、RIP、慢病毒稳转株的建立（过表达/敲低）、q-pcr、WB，其中CHIP、RIP为本公司主营项目。

一、 RIP实验: 主要研究蛋白与RNA的相互作用

本实验分别用EZH2和DNMT1抗体从A549和H1299细胞钓取与蛋白结合的LncRNA，洗脱RNA，反转录，qPCR检测,以IgG作为对照，表明HOXA11-AS与蛋白EZH2、DNMT1结合。我公司在实验体系中设置阳性及阴性对照，进一步排除系统误差。

二、 CHIP实验：主要研究蛋白与基因启动子之间的关系

用EZH2、DNMT1抗体分别钓取si-HOXA11-AS细胞和si-NC细胞中与蛋白结合的DNA片段，然后用miR-200b启动子序列引物进行q-pcr检测，表明si-HOXA11-AS细胞蛋白与mir-200b启动子的结合下降。说明蛋白与mir-200b启动子的结合与Lnc HOXA11-AS有关。

参考文献：Jian‑Hui Chen , Li‑Yang Zhou, Suo Xu，et al. Overexpression of lncRNA HOXA11-AS promotes cell epithelial–mesenchymal transition by repressing miR-200b in non-small cell lung cancer［J］. Cancer Cell Int,2017,10.1186