转录调控-转录激活机制研究案例（三）

一、调控通路

细胞在低氧的环境下，LncRNA HIFCAR结合到HIF-1a靶标基因的启动子上招募HIF-1a和P300形成转录复合体，促进基因的转录，从而促进肿瘤进程。

二、实验流程

作者首先通过对低氧处理的细胞、肿瘤细胞、正常组织细胞检测LncRNA HIFCAR的表达和临床检测确定本文的主角。对LncRNA HIFCAR的研究作者分为功能和机理研究。功能实验包含对LncRNA HIFCAR敲低、低氧处理细胞后检测细胞的增殖、侵袭和转移、肿瘤成球和小鼠体内成瘤等。机理实验：首先是检测LncRNA HIFCAR对HIF-1a靶标基因表达的影响，作者通过LncRNA HIFCAR的过表达/敲低和低氧处理后检测靶标基因的表达验证LncRNA HIFCAR对HIF-1a靶标基因表达的促进作用。然后是LncRNA HIFCAR与HIF-1a互作使形成蛋白复合物，作者通过荧光素酶实验、RIP、RNA pull-down 和co-IP验证LncRNA HIFCAR与HIF-1a和P300的关系。最后是验证LncRNA HIFCAR、HIF-1a和P300结合到靶标基因启动子上，作者通过CHIRP和CHIP实验来验证。

三、核心FIGURE

Figure1说明的是LncRNA HIFCAR/MIR31HG通过与HIF-1a互作激活靶标基因的表达。

A、q-pcr检测LncRNA HIFCAR和RMRP表达细胞中HIF-1a的靶标基因的RNA表达水平，表明LncRNA HIFCAR表达使HIF-1a的靶标基因表达上升。

B、q-pcr检测不同数量的LncRNA HIFCAR过表达细胞的HIF-1a的靶标基因的RNA表达水平，表明随着LncRNA HIFCAR表达升高，HIF-1a的靶标基因的RNA表达也升高。

C、q-pcr检测CoCl2处理的LncRNA HIFCAR敲低细胞的HIF-1a的靶标基因的RNA表达水平，表明LncRNA HIFCAR敲低使HIF-1a的靶标基因的RNA表达降低，CoCl2处理使HIF-1a的靶标基因的RNA表达升高。

D、q-pcr检测低氧处理的LncRNA HIFCAR敲低细胞的HIF-1a的靶标基因的RNA表达水平，表明LncRNA HIFCAR敲低使HIF-1a的靶标基因的RNA表达降低，低氧处理使HIF-1a的靶标基因的RNA表达升高。

E、荧光素酶实验，将HIF-1a受体序列连接到荧光素酶基因的启动子区，与LncRNA HIFCAR表达质粒共转染细胞后检测荧光素酶活性，表明在添加HIF-1a和LncRNA HIFCAR使荧光素酶活性显著增强。

F、荧光素酶实验，将HIF-1a受体序列连接到荧光素酶基因的启动子区，与LncRNA HIFCAR敲低质粒共转染细胞后检测荧光素酶活性，表明LncRNA HIFCAR敲低降低荧光素酶活性，而添加HIF-1a和低氧处理后使荧光素酶活性显著增强。

Figure2说明的是LncRNA HIFCAR与HIF-1a结合作为HIF-1a的共激活剂。

A、WB检测经低氧处理后的LncRNA HIFCAR敲低和过表达细胞的HIF-1a表达水平，表明LncRNA HIFCAR敲低或过表达不影响HIF-1a的表达，而低氧处理促使HIF-1a表达。

B、RIP实验，用HIF-1a抗体钓取低氧处理和不处理细胞中与HIF-1a蛋白结合的RNA，然后进行Q-PCR检测，表明低氧处理会使HIF-1a与LncRNA HIFCAR显著升高。

C-E、RNA pull-down，不同片段的LncRNA HIFCAR钓取结合的蛋白验证了与HIF-1a结合的RNA区段。

F、对LncRNA HIFCAR全长和501-1500区段过表达后检测HIF-1a靶标基因的表达，表明LncRNA HIFCAR全长过表后HIF-1a靶标基因的表达升高，而501-1500区段过表达后，HIF-1a靶标基因的表达比全长过表达显著降低。

G、GST-pull-down，将HIF-1a不同区段与GST标签进行融合表达后钓取与融合蛋白结合的RNA然后检测LncRNA HIFCAR，表明HIF-1a结合LncRNA HIFCAR的区域在201-329位氨基酸之间。

H、co-IP，用HIF-1a抗体从低氧处理和未处理的LncRNA HIFCAR敲低细胞中钓取结合的蛋白，表明低氧处理促使HIF-1a复合体形成。

Figure3说明的是LncRNA HIFCAR结合到HIF-1a靶标基因启动子上招募HIF-1a和P300结合到启动子上.

A、  CHIRP，用LncRNA HIFCAR探针钓取低氧处理和未处理细胞中与之结合的DNA片段，然后进行Q-PCR检测，表明经低氧处理后的细胞LncRNA HIFCAR结合到HIF-1a靶标基因启动子上。

B-C、ChIP，分别用HIF-1a和P300抗体钓取低氧处理和未处理的LncRNA HIFCAR敲低细胞中与蛋白结合的DNA片段，然后进行Q-PCR检测，表明低氧处理后细胞中HIF-1a和P300结合到HIF-1a靶标基因启动子上，而LncRNA HIFCAR敲低会使结合降低。

                     我们公司可以提供的技术服务

本公司可进行以上类似实验的实验设计及整体实验外包项目，包括Luciferase检测、q-pcr、RIP、RNA pull-down、co-IP、CHIRP、ChIP、WB、慢病毒稳转株的建立（过表达/敲低），其中CHIP、Luciferase检测、EMSA、pull-down为本公司主营项目。

一、Luciferase检测：检测转录因子和其靶启动子中的特异序列结合的重要手段

将HIF-1a受体序列连接到荧光素酶基因的启动子区，与LncRNA HIFCAR表达质粒或敲低质粒共转染细胞后检测荧光素酶活性，表明在添加HIF-1a和LncRNA HIFCAR使荧光素酶活性显著增强。

二、RIP技术：是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术。

用HIF-1a抗体钓取低氧处理和不处理细胞中与HIF-1a蛋白结合的RNA，然后进行Q-PCR检测，表明低氧处理会使HIF-1a与LncRNA HIFCAR显著升高。我公司在实验体系中设置阳性及阴性对照，进一步排除系统误差。

三、RNA pull-down：检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间相互作用的主要实验手段之一。

左图是用LncRNA HIFCAR全长探针钓取细胞中与之结合的蛋白，右图是用LncRNA HIFCAR不同片段探针钓取细胞中与之结合的蛋白，然后用HIF-1a抗体检测pull-down产物蛋白，表明LncRNA HIFCAR与HIF-1a的结合区域不在501-1500。我公司在实验体系中同时提供lncRNA正义链与反义链的pull down。

四、co-IP：确定两种细胞在完整细胞内生理性相互作用的有效方法

用HIF-1a抗体钓取LncRNA HIFCAR敲低和未敲低细胞中与之结合的蛋白，产物进行WB检测，表明HIF-1a与P300结合形成复合体，而LncRNA HIFCAR敲低细胞中结合降低。

五、CHIRP：是一种检测与RNA绑定的DNA和蛋白相互作用的方法

用LncRNA HIFCAR探针钓取低氧处理和未处理细胞中与之结合的DNA片段，然后进行Q-PCR检测，表明低氧处理后的细胞LncRNA HIFCAR结合到HIF-1a靶标基因启动子上增加。我公司在实验体系中同时提供lncRNA正义链与反义链的pull down。

六、CHIP技术：主要研究蛋白与基因启动子之间的关系

分别用HIF-1a和P300抗体钓取低氧处理和未处理的LncRNA HIFCAR敲低细胞中与蛋白结合的DNA片段，然后进行Q-PCR检测，表明低氧处理后细胞中HIF-1a和P300结合到HIF-1a靶标基因启动子上，而LncRNA HIFCAR敲低会使结合降低。

参考文献：Jing-Wen Shih, Wei-Fan Chiang, Alexander T.H. Wu,et al. Long noncoding RNA Lnc HIFCAR/MIR31HG is aHIF-1a co-activator driving oral cancer progression［J］. NATURE COMMUNICATIONS,2017, 8:15874