转录抑制机制研究案例（三）

一、调控通路

本文描述的是在细胞因子IL-6刺激下，IL-6受体（IL-6R）激活转录因子STAT3使其结合到MIR34A基因上，STAT3结合到基因上会阻碍基因的转录使miR-34a表达降低；在DOX处理细胞后，miR-34a表达量升高时，这时miR-34a与IL-6R Mrna的3’UTR结合抑制IL-6R蛋白的表达，从而使STAT3不能结合到MIR34A基因上抑制其表达，形成了一种调控循环回路。

二、实验流程

作者首先通过用IL-6处理细胞后检测EMT相关基因的mRNA表达，然后对STAT3和IL-6受体（IL-6R）敲低后检测细胞的侵袭说明IL-6诱导STAT3和IL-6R影响细胞的侵袭；用IL-6处理细胞后检测miR-34a初始转录本和成熟体的表达，并且用STAT3抗体进行ChIP实验获取与STAT3结合的DNA片段说明IL-6通过促进STAT3结合到MIR34A基因上抑制mir-34a的转录表达；为了验证IL-6R的3’-UTR与miR-34A的关系，作者进行了荧光素酶实验，表明miR-34a与IL-6R的3’-UTR互作抑制mRNA的翻译表达；对STAT3和IL-6R敲低后检测STAT3、IL-6R、miR-34a初始转录本和成熟体的表达，miR-34a表达后检测STAT3和IL-6R的表达，表明STAT3与IL-6R是正相关的，STAT3、IL-6R与miR-34a是负相关；作者最后进行细胞功能实验，对STAT3和IL-6R敲低细胞进行细胞侵袭、转移、小鼠体内成瘤等实验研究STAT3、IL-6R的功能。

三、核心FIGURE

Figure1说明的是IL-6诱导转录因子STAT3结合到MIR34A基因上抑制miR-34a的转录表达。

A、  用细胞因子IL-6处理细胞后检测miR-34a的初始转录本和成熟体，表明IL-6处理后miR-34a的初始转录和成熟体都降低。说明IL-6使MIR34A基因转录降低。

B、  用细胞因子IL-6处理HT-29和MCF7两种细胞后检测miR-34a成熟体，表明IL-6处理后，细胞的miR-34a表达均下降。

C、 CHIP实验，用细胞因子IL-6处理细胞后用STAT3抗体获取与转录因子STAT3结合的DNA片段，然后进行q-pcr检测，表明IL-6处理后STAT3结合到MIR34A基因上升。

D、构建STAT3敲低细胞株，然后用IL-6处理细胞后检测miR-34a的初始转录本，表明IL-6处理后转录降低，而STAT3敲低细胞IL-6处理后转录降低的程度明显低于未敲低细胞。

Figure2说明的是miR-34a与IL-6R mRNA的3’UTR结合抑制IL-6R蛋白的表达。

A、IL-6R的3’-UTR与miR-34结合位点的预测。

B、 对IL-6R的3’-UTR与miR-34结合位点进行突变后连接到荧光素酶报告质粒上，与miR-34共转染人源HCT116细胞，然后检测荧光素酶活性表明miR-34能与IL-6R的3’-UTR互作抑制荧光素酶活性，而结合位点突变后抑制作用降低。

C、将IL-6R的3’-UTR序列连接到荧光素酶报告质粒上，与miR-34共转染小鼠细胞，同样证明了miR-34与IL-6R的3’-UTR互作抑制荧光素酶活性。

Figure3说明的是miR-34a抑制STAT3和IL-6R，STAT3和IL-6R则是相互促进的关系。

A、分别对STAT3和IL-6R敲低后检测STAT3和IL-6R等蛋白的表达和miR-34a的初始转录本的表达，表明STAT3敲低后IL-6R的表达降低，IL-6R敲低后STAT3表达降低，而STAT3和IL-6R敲低后都使miR-34a的初始转录升高。

B、将miR-34a初始转录序列进行表达后检测成熟的miR-34a的表达，表明miR-34A成熟体升高。

C、 将miR-34a初始转录序列进行表达后检测细胞的侵袭能力，表明miR-34的表达使细胞侵袭能力下降。

D、将miR-34a初始转录序列进行表达后检测STAT3、IL-6R等蛋白的表达，表明miR-34的STAT3、IL-6R等蛋白的表达具有抑制作用。

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一、    CHIP技术：主要研究蛋白与基因之间的关系。

作者首先用细胞因子IL-6处理细胞后用STAT3抗体获取细胞中与STAT3蛋白结合的DNA片段然后用MIR34A基因引物进行q-pcr检测，表明IL-6处理后细胞中STAT3结合到MIR34A基因增加。

二、Luciferase检测：验证microRNA与靶标3’-UTR的互作。

分别将IL-6R mRNA的3’-UTR序列和突变序列连接到荧光素酶报告载体上，与miR-34共转染细胞，然后检测荧光素酶活性，表明miR-34通过IL-6R的3’-UTR抑制荧光素酶活性。

参考文献：Matjaz Rokavec,Meryem Gülfem Öner,Huihui Li,et al.IL-6R/STAT3/miR-34a feedback loop promotes EMT-mediated colorectal cancer invasion and metastasis[J]. J Clin Invest,2014,124(4):1853–1867