转录调控-转录激活机制研究案例（二）

一、  调控通路

在癌细胞中，c-Myc结合到LncRNA HOTAIR基因的启动子上激活基因转录，促进LncRNA HOTAIR的表达，LncRNA HOTAIR对miR-130a进行海绵吸附作用负调控miR-130a促进肿瘤相关蛋白的表达从而促进肿瘤细胞增殖。

二、  实验流程

   作者先对胆囊癌细胞和非癌组织细胞的LncRNA HOTAIR表达量进行检测说明胆囊癌细胞中LncRNA HOTAIR高表达，然后通过对c-Myc过表达和敲低检测LncRNA HOTAIR表达说明c-Myc对LncRNA HOTAIR表达的促进作用；为了说明c-Myc对LncRNA HOTAIR表达的作用机制，作者分别用CHIP和EMSA验证c-Myc与LncRNA HOTAIR基因启动子的E-box结合表明作用位点为E-box；为了说明LncRNA HOTAIR与miR-130的相互负调控作用，作者先对LncRNA HOTAIR过表达和敲低后检测miR-130的表达，荧光素酶实验以及LncRNA HOTAIR敲低后MiR-130前体和成熟体的表达表明LncRNA HOTAIR不影响前体的表达，然后用RNA pull-down实验说明LncRNA HOTAIR与AGO2结合，最后通过在细胞培养过程中添加LncRNA HOTAIR探针后检测miR-130表达来说明LncRNA HOTAIR对miR-130的负调控作用。

三、核心FIGURE

Figure1说明的是LncRNA HOTAIR的表达受c-Myc的正调控。

A、q-pcr检测c-Myc过表达后c-Myc mRNA的表达水平；

B、WB检测c-Myc过表达后c-Myc 蛋白的表达水平；

C、q-pcr检测c-Myc过表达后LncRNA HOTAIR的表达水平，表明了c-Myc过表达使LncRNA HOTAIR表达升高；

D、q-pcr检测c-Myc敲低后c-Myc mRNA的表达水平；

E、WB检测c-Myc敲低后c-Myc 蛋白的表达水平；

F、q-pcr检测c-Myc敲低后LncRNA HOTAIR的表达水平，表明了c-Myc敲低使LncRNA HOTAIR表达降低。

Figure2说明的是c-Myc与LncRNA HOTAIR基因启动子的E-box结合激活基因的转录。

A-B、荧光素酶检测c-Myc过表达或敲低对LncRNA HOTAIR启动子活性的影响，表明c-Myc过表达使LncRNA HOTAIR启动子活性升高，c-Myc敲低使LncRNA HOTAIR启动子活性降低；

C、对LncRNA HOTAIR启动子的E-box突变后连到荧光素酶报告质粒上；

D-E、荧光素酶检测c-Myc过表达或敲低对LncRNA HOTAIR启动子E-box突变后活性的影响，表明突变后启动子活性不受c-Myc的影响。

F、CHIP实验，用c-Myc抗体钓取LncRNA HOTAIR启动子野生型和E-box敲除的细胞中结合的DNA片段，然后进行Q-PCR检测，表明E-box敲除后c-Myc与启动子结合显著降低。

G、EMSA检测c-Myc与LncRNA HOTAIR启动子在体外的结合。星号表示带生物素标记的寡核苷酸。

Figure3说明的是LncRNA HOTAIR与miR-130a具有相互的负调控作用。

A、LncRNA HOTAIR的敲低检测。

B-C、分别用Q-PCR和Northern blot检测LncRNA HOTAIR敲低后的miR-130a的表达，表明LncRNA HOTAIR敲低后miR-130a表达升高。

D、LncRNA HOTAIR的过表达检测。

E-F、分别用Q-PCR和Northern blot检测LncRNA HOTAIR过表达后的miR-130a的表达，表明LncRNA HOTAIR过表达后miR-130a表达降低。

G、miR-130a mimic的lncRNA HOTAIR表达检测，表明miR-130a过表达后lncRNA HOTAIR表达降低。

H、miR-130a 抑制后的lncRNA HOTAIR表达检测，表明miR-130a抑制后后lncRNA HOTAIR表达升高。

I、荧光素酶实验，检测lncRNA HOTAIR与miR-130a的关系，表明miR-130a与lncRNA HOTAIR结合抑制上游基因表达。

J、检测lncRNA HOTAIR敲低后的成熟miR-130a和其前提的表达，表明lncRNA HOTAIR不影响miR-130a的转录。

K、RNA pull-down，用lncRNA HOTAIR探针钓取与之结合的蛋白，然后用AGO2抗体检测产物，表明lncRNA HOTAIR与AGO2结合。

L、在细胞培养过程中添加lncRNA HOTAIR探针，然后检测细胞的miR-130a，表明添加lncRNA HOTAIR探针，miR-130a含量升高。

                     我们公司可以提供的技术服务

本公司可进行以上类似实验的实验设计及整体实验外包项目，包括CHIP、Luciferase检测、EMSA、q-pcr、RNA pull-down、WB、慢病毒稳转株的建立（过表达/敲低），其中CHIP、Luciferase检测、EMSA、pull-down为本公司主营项目。

一、CHIP：主要研究蛋白与基因启动子之间的关系

作者用c-Myc抗体钓取细胞中与蛋白结合的DNA片段，然后进行Q-PCR检测，结果表明c-Myc与lncRNA HOTAIR启动子结合，而当启动子的E-box缺失时结合降低，说明结合位点在E-box。

作者用c-Myc抗体钓取细胞中与蛋白结合的DNA片段，然后进Q-PCR检测，结果表明c-Myc与lncRNA HOTAIR启动子结合，而当动子的E-box缺失时结合降低，说明结合位点在E-box。

二、Luciferase检测：检测转录因子和其靶启动子中的特异序列结合的重要手段，也是检测LncRNA、microRNA与靶标基因3’-UTR关系的重要手段。

启动子活性检测，检测c-Myc过表达或敲低对LncRNA HOTAIR启动子活性的影响，表明c-Myc过表达使LncRNA HOTAIR启动子活性升高，c-Myc敲低使LncRNA HOTAIR启动子活性降低。

3’-UTR荧光素酶活性检测，将LncRNA HOTAIR连接到荧光素酶基因的3’端，检测miR-130a对荧光素酶活性的影响，表明miR-130a与LncRNA HOTAIR互作抑制上游基因的表达。

三、EMSA：验证目的基因片段与蛋白结合的重要手段。

检测c-Myc与LncRNA HOTAIR启动子在体外的结合，星号表示带生物素标记的寡核苷酸。表明启动子的E-box结合c-Myc。

四、RNA pull-down：检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间相互作用的主要实验手段之一。

用lncRNA HOTAIR探针钓取与之结合的蛋白，然后用AGO2抗体检测产物，表明lncRNA HOTAIR与AGO2结合。我公司在实验体系中同时提供lncRNA正义链与反义链的pull down。

参考文献：Ming-zhe Ma, Chun-xiao Li, Yan Zhang,et al. Long non-coding RNA HOTAIR, a c-Myc activateddriver of malignancy, negatively regulates mi RNA-130a in gallbladder cancer［J］. Molecular Cancer,2014, 13:156