转录激活机制研究案例（五）

文献影响因子：7.

一、调控通路

在细胞DNA损伤的情况下，P53促进LncRNA PINCR表达，然后PINCT招募Matrin-3与P53结合形成复合体结合到P53靶标基因的增强子区域，促进基因的表达使细胞抗死亡能力增强。

二、实验流程

作者首先通过药理抑制P53与Matrin-3活性后的基因芯片筛选P53靶标基因和LncRNA，用Matrin-3处理细胞后进行q-pcr检测几种RNA的表达筛选出本文主角PINCR。用DOXO（阿霉素：DNA损伤处理）处理P53野生型和P53删除细胞后检测PINCR的表达说明DNA损伤后PINCR受P53诱导表达；为了验证P53对PINCR的作用，作者分别进行荧光素酶实验和ChIP实验说明P53促进PINCR启动子活性。在研究PINCR的功能是，作者首先进行核质分离后检测PINCR，表明PINCR在细胞核中可能参与基因转录过程的调控，然后再进行RNA pull-down、ChIP、co-IP等分别说明PINCR与P53/Matrin-3结合、P53与Matrin-3结合、P53/Matrin-3与靶标基因的启动子和增强子结合。

三、核心FIGURE

Figure1说明的是PINCR是在细胞DNA损伤后由P53直接调控的核内LncRNA。

A、q-pcr检测经Nutlin-3诱导后的结直肠癌癌三种细胞系的P53靶标基因表达，表明PINCR表达升高；

B、q-pcr检测经DOXO（阿霉素：DNA损伤处理）处理后的P53野生型和突变型细胞的PINCR表达，表明DNA损伤后PINCR表达升高，而P53突变后的PINCR表达明显比野生型低，说明PINCR表达与P53有关。

C、ChIP-SEQ，分别用Nutlin、5-FU、RITA和CTL处理细胞后用P53抗体获取与P53结合的DNA片段，产物进行高通量测序，表明Nutlin-3可使P53结合到PINCR启动子上。

D、ChIP-qpcr，细胞经DOXO（阿霉素：DNA损伤处理）处理后用P53抗体获取与P53结合的DNA片段，然后进行Q-PCR检测，表明细胞DNA损伤后P53结合到PINCR启动子上升。

E-F、荧光素酶实验，将PINCR启动子序列连接到荧光素酶报告质粒上，与P53表达质粒共转染细胞，然后检测荧光素酶活性，表明P53促进PINCR启动子活性。

H、核质分离后分别检测细胞核和细胞质的RNA含量，表明PINCR基本在细胞核中，说明PINCR可能参与的是核内基因的转录调控。

Figure2说明的是在DNA损伤时PINCR减少使G1捕获降低即增加细胞死亡。

A、 用CRISPR/Cas9在HCT116细胞中删除基因组上的PINCR基因，然后用Q-PCR检测DOXO处理后的细胞PINCR的表达，表明DOXO处理细胞后PINCR升高，而删除基因后PINCR不能表达。

B-C、采用PI染色做流式细胞术检测细胞凋亡，DOXO处理细胞后删除基因组上的PINCR基因的细胞系细胞凋亡明显比PINCR野生型的多。

D、在删除基因组上的PINCR基因的细胞中转染PINCR表达质粒后检测PINCR表达，表明PINCR在细胞中表达。

E、在删除基因组上的PINCR基因的细胞中转染PINCR表达质粒后检测细胞凋亡，表明PINCR表达使细胞凋亡减少。

F、FISH检测核孔蛋白和细胞凋亡蛋白，表明DNA损伤后，基因组上删除了PINCR的细胞细胞凋亡蛋白表达增加。

G、克隆形成观察，DOXO处理细胞后，细胞的生长减少，基因组上删除了PINCR的细胞明显比野生型细胞生长少。

Figure3说明的是DNA损伤后，PINCR调控P53靶标基因的表达。

A、 DNA损伤处理后用P53处理的细胞检测靶标基因表达上升的示意图，包含PINCR依赖和非依赖基因。

B、 用5-氟尿嘧啶处理PINCR野生型和删除细胞后检测细胞PINCR依赖的P53靶标基因mRNA的表达，表明5-氟尿嘧啶处理后mRNA表达增加，而PINCR删除的细胞mRNA表达升高的比野生型的低。

C、 用5-氟尿嘧啶处理PINCR野生型和删除细胞后，用P53抗体获取细胞中与蛋白结合的DNA片段，然后进行q-pcr检测，表明表明5-氟尿嘧啶处理后P53结合到其靶标基因启动子上增加，而PINCR删除的细胞结合的比野生型的低。

D、 用5-氟尿嘧啶处理PINCR敲低细胞后进行q-pcr检测PINCR和P53靶标基因的表达，表明PINCR敲低后基因表达降低。

   E-F、PI染色的流式细胞术检测细胞凋亡，表明PINCR敲低后细胞凋亡增加。

Figure4说明的是Matrin-3与PINCR结合作为PINCR下游效应因子。

A、 RNA pull-down，用生物素标记的PINCR探针获取细胞中与之结合的蛋白，然后进行多肽光谱分析，表明DOXO处理细胞后，PINCR与Matrin-3结合增加。

B-C、RNA pull-down，用生物素标记的PINCR探针获取DOXO处理后细胞中与之结合的蛋白，然后进行WB检测，表明PINCR与Matrin-3结合。

D、 RIP，用Matrin-3抗体获取5-氟尿嘧啶处理的细胞中与蛋白结合的RNA，然后进行q-pcr检测，表明PINCR与Matrin-3结合。

A、 将Matrin-3敲低质粒转染PINCR-WT细胞中，然后进行WB检测Matrin-3的表达。

B、 5-氟尿嘧啶处理Matrin-3敲低质粒转染的PINCR-WT和PINCR删除细胞，然后进行PI流式细胞术检测细胞凋亡，表明Matrin-3敲低后细胞凋亡增加。

C、 5-氟尿嘧啶处理Matrin-3敲低质粒转染的PINCR-WT和PINCR删除细胞，然后q-pcr检测P53靶标基因的表达，表明Matrin-3敲低后靶标基因表达降低。

Figure5说明的是Matrin-3与P53形成复合体结合到PINCR靶标基因的增强子区域。

A、 co-IP，用Matrin-3抗体获取与之结合的蛋白，然后进行WB检测，表明P53与Matrin-3结合

B、 co-IP，用5-氟尿嘧啶处理细胞后细胞提取物分别用Rnase A和Dnase处理然后用Matrin-3抗体获取与蛋白结合的蛋白，表明P53与Matrin-3是直接结合的。

C、 用5-氟尿嘧啶处理PINCR-WT和PINCR删除细胞后用Matrin-3抗体获取与蛋白结合的DNA片段然后进行q-pcr检测，表明5-氟尿嘧啶处理处理后Matrin-3与P53靶标基因启动子结合上升。

D、 用5-氟尿嘧啶处理Matrin-3敲低细胞然后用P53抗体获取与P53结合的DNA片段进行q-pcr检测，表明Matrin-3敲低不影响P53与靶标基因启动子结合。

E、 ChIP，用5-氟尿嘧啶处理PINCR-WT和PINCR删除细胞后用Matrin-3抗体获取与蛋白结合的DNA片段，然后用q-pcr检测P53靶标基因的增强子区，表明5-氟尿嘧啶处理后Matrin-3与P53靶标基因增强子结合增加。

F、 用5-氟尿嘧啶处理PINCR-WT和PINCR删除细胞后用Matrin-3抗体获取与蛋白结合的DNA片段然后进行q-pcr检测，表明5-氟尿嘧啶处理处理后P53与靶标基因增强子结合上升。

G、 用5-氟尿嘧啶处理Matrin-3敲低细胞然后用P53抗体获取与P53结合的DNA片段进行q-pcr检测，表明表明5-氟尿嘧啶处理后P53与靶标基因增强子结合增加，而Matrin-3敲低细胞P53与靶标基因增强子结合不增加。

                       我们公司可以提供的技术服务

本公司可进行以上类似实验的实验设计及整体实验外包项目，包括q-pcr、Luciferase assay、FISH、RNA pull-down、co-IP、ChIP、WB、慢病毒稳转株的建立（过表达/敲低），其中核质分离分离、FISH、RNA pull-down、co-IP、ChIP为本公司主营项目。

一、Luciferase assay：荧光素酶实验检测转录因子与基因启动子之间的关系。

将PINCR启动子序列连接到荧光素酶报告质粒上，与P53表达质粒共转染细胞，然后检测荧光素酶活性，表明P53促进PINCR启动子活性。

二、FISH：免疫荧光原位杂交技术，对细胞中的蛋白、RNA、DNA进行定位和定量。

分别用DOXO和CTL处理PINCR野生型和PINCR删除的细胞，然后FISH检测核孔蛋白和细胞凋亡蛋白的表达，表明DNA损伤后，基因组上删除了PINCR的细胞中细胞凋亡蛋白的表达增加。

三、RNA pull-down：检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间相互作用的主要实验手段之一。

用生物素标记的PINCR探针获取DOXO处理后细胞中与之结合的蛋白，然后进行WB检测，表明PINCR与Matrin-3结合。我公司在实验体系中同时提供lncRNA正义链与反义链的pull down。

四、      ChIP：主要研究蛋白与基因之间的关系。

用5-氟尿嘧啶处理PINCR野生型和PINCR删除的细胞后，分别用Matrin-3和P53抗体获取与相应蛋白结合的DNA片段，然后用q-pcr检测P53靶标基因的增强子，表明5-氟尿嘧啶处理后P53和Matrin-3结合到增强子区域增多，而PINCR删除的细胞结合比野生型细胞少。说明P53和Matrin-3结合到基因增强子受PINCR调控。我公司在实验体系中设置阳性及阴性对照，进一步排除系统误差。

五、      CO-IP：研究蛋白与蛋白互作的重要手段。

用5-氟尿嘧啶处理细胞后的细胞提取物分别用Rnase A和Dnase处理，然后用Matrin-3抗体获取与蛋白结合的蛋白进行WB检测，表明P53与Matrin-3直接结合的。

参考文献：Ritu Chaudhary,Berkley Gryder,Wendy S Woods,et al. Prosurvival long noncoding RNA PINCR regulates a subset of p53 targets in human colorectal cancer cells by binding to Matrin 3[J]. eLife,2017,6:e23244