转录调控-转录抑制机制研究案例（一）

（一）调控机制：

在细胞核内，转录因子FOXD3受阿司匹林诱导表达，然后结合到LncOLA1P2启动子上促进LncOLA1P2表达。LncOLA1P2出核在细胞质中与磷酸化的STAT3结合防止形成p-STAT3二聚体从而调控细胞活动。

（二）实验流程：

作者首先通过LncRNA的微阵列分析和Q-PCR检测不同组织细胞LncOLA1P2的表达确定本文的主角LncOLA1P2，然后再功能和机制研究。Lnc OLA1P2功能实验：建立LncOLA1P2过表达/敲低稳定细胞株，注射到动物体内的检测肿瘤生长。LncOLA1P2机制研究：作者研究LncOLA1P2的机制分为三部分，首先利用DNA pull down-质谱技术，筛选受阿司匹林影响且与OLA1P2 promoter区结合的转录因子，分别用Q-PCR和Western Blot检测阿司匹林处理后的细胞FOXD3 mRNA、蛋白的表达和FOXD3启动子去甲基化来说明ASP诱导转录因子FOXD3表达。然后用CHIP实验验证转录因子与LncOLA1P2启动子结合促进表达。最后是OLA1P2抑制磷酸化的STAT3二聚体形成，在这个部分的研究作者使用RNA pull-down和RIP验证OLA1P2与p-STAT3的结合，然后进行WB检测p-STAT3的形成情况。

（三）核心FIGURE：

Figure1说明的是阿司匹林通过诱导FOXD3蛋白的表达促进LncRNA OLA1P2的含量升高。

A、DNA pull-down，用LncRNA OLA1P2启动子探针钓取与之结合的蛋白，产物进行MS质谱分析，筛选出来与启动子结合的转录因子蛋白FOXD3。

B、分别用Q-PCR和Western Blot检测阿司匹林处理后的细胞FOXD3 mRNA、蛋白的表达和FAXD3启动子甲基化，figure表明ASP通过诱导FOXD3启动子去甲基化促进蛋白表达。

C、QRT-PCR检测经阿司匹林处理后细胞的LncRNA OLA1P2的表达升高。

D、CHIP实验，用FOXD3抗体钓取与蛋白结合的DNA片段，检测结合的OLA1P2启动子区域。

E、荧光素酶检测验证FOXD3与OLA1P2启动子区结合促进基因表达。

Figure2说明的是OLA1P2通过与磷酸化的STAT3结合阻止磷酸化STAT3二聚体形成从而阻止其进入细胞核。

A、用WB检测OLA1P2敲低或过表达时的STAT3，说明OLA1P2不影响STAT3的磷酸化。

B、通过检测细胞核和细胞质中的OLA1P2说明OLA1P2只在细胞质中。

C、用WB检测OLA1P2敲低时细胞质和细胞核中的磷酸化的STAT3，说明OLA1P2能阻止磷酸化的STAT3进入细胞核。

D、 RIP和RNA pull-down检测Lnc OLA1P2与磷酸化的STAT3结合的区域。

E、通过免疫沉淀和免疫印迹检测OLA1P2过表达和敲低后的P-STAT3二聚体的形成，表明OLA1P2过表达抑制二聚体形成。

F、通过免疫沉淀和免疫印迹检测用OLA1P2处理蛋白样品后的P-STAT3二聚体的形成，表明OLA1P2抑制二聚体形成。

本公司可提供的技术服务

本公司可进行以上类似实验的实验设计及整体实验外包项目，包括DNA pull-down、Q-PCR、Western Blot、CHIP实验、Luciferase检测、慢病毒稳转株的建立（过表达/敲低）、RIP、RNA pull-down，其中的DNA pull-down、CHIP实验、Luciferase检测、RIP、RNA pull-down为本公司主营项目。

一、 DNA pull-down: 主要研究DNA promoter与转录因子的相互作用，主要用于筛选未知转录因子。

用OLA1P2启动子DNA探针钓取与启动子结合的蛋白，然后用质谱分析pull-down产物筛选转录因子。

二、 CHIP技术：主要研究蛋白与基因启动子之间的关系。

通过CHIP获取与转录因子蛋白FOXD3结合的DNA，联用Q-PCR检测表明了FOXD3结合到OLA1P2启动子的P1位点上。

三、 Luciferase检测：检测转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合

luciferase Assay是检测转录因子和其靶启动子中的特异序列结合的重要手段，通过荧光素酶活性检测证明转录因子蛋白FOXD3激活OLA1P2启动子促进基因表达。

四、 RIP实验技术：主要研究蛋白与RNA的相互作用

利用p-STAT3抗体钓取与之结合的RNA，然后进行QRT-PCR检测产物RNA，证明了p-STAT3与LncOLA1P2结合，结合位点为P1区段。我公司在实验体系中设置阳性及阴性对照，进一步排除系统误差。

五、 RNA pull-down：RNA pull-down是检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间相互作用的主要实验手段之一。

用生物素标记的RNA探针钓取与之结合的蛋白，然后进行WB检测预测结合的目的蛋白，证明p-STAT3与LncOLA1P2的P1区段结合。

六、FISH技术：免疫荧光原位杂交，对细胞中的核酸和蛋白进行定性、定位和定量检测。

A为单一的RNA在细胞内的定位，表明LncRNA OLA1P2存在与细胞质中，说明其可能是在转录后调控起作用；B为RNA-蛋白在细胞内的共定位，表明了LncRNA与蛋白存在于细胞质中具有重叠区域，说明两种存在互作关系。我公司在实验体系中设置阴性和阳性对照。

参考文献：Haiyan Guo, Jun Liu, Qiwen Ben，et al. The aspirin-induced long non-coding RNA OLA1P2 blocks phosphorylated STAT3 homodimer formation［J］. Genome Biology,2014, 10.1186