转录调控-转录激活机制研究案例(一)

（一）调控通路：

  当Lnc-DC低表达时，SHP1与磷酸化的转录因子STAT3结合并对其进行去磷酸化作用，抑制靶标基因表达，从而抑制细胞分化；当Lnc-DC高表达时，Lnc-DC与磷酸化的转录因子STAT3结合并阻止SHP1的去磷酸化，促进下游靶标基因表达，从而促进细胞分化。

（二）实验流程

  作者首先通过对树突细胞和外周血单细胞进行转录组分析，然后进行qPCR验证筛选出表达异常的Lnc-DC。对Lnc-DC的研究，作者从Lnc-DC的表达途径和Lnc-DC的功能两方面进行。（1）Lnc-DC的表达：用CHIP-seq的方法检测到PVT1与Lnc-DC启动子结合，然后进行Lnc-DC启动子的荧光素酶检测证实PVT1激活Lnc-DC启动子促进下游基因的表达。（2）Lnc-DC的功能：通过RNA pull-down和RIP验证Lnc-DC与磷酸化的STAT3的结合，然后进行Lnc-DC与SHP1的竞争结合磷酸化的STAT3实验验证Lnc-DC与SHP1具有竞争结合磷酸化的STAT3作用。

（三）核心FIGURE：

Figure1说明的是PU.1与Lnc-DC启动子区结合

A、 用CHIP-seq检测与几种蛋白结合的DNA片段，筛选出与Lnc-DC高结合的PU.1

B、 Luciferase检测与PU.1结合的Lnc-DC启动子区域

Figure2说明的是Lnc-DC与SHP1竞争结合pSTAT3抑制SHP1对pSTAT3去磷酸化。

A、 RNA pull-down钓取与Lnc-DC结合的蛋白，用STAT3抗体进行WB检测产物，表明Lnc-DC结合STAT3。

B、 RIP，用STAT抗体钓取RNA并进行Q-PCR验证了Lnc-DC与STAT3结合

C、 RNA-蛋白FISH，对细胞内的RNA与蛋白的共定位。

D、 WB检测Lnc-DC敲低细胞中的STAT3和pSTAT3，表明Lnc-DC敲低时pSTAT3含量减少。

E、 竞争实验，通过Lnc-DC与SHP1竞争实验验证了Lnc-DC能竞争性结合pSTAT3防止其被SHP1去磷酸化作用。

      我们公司可以提供的技术服务

本公司可进行以上类似实验的实验设计及整体实验外包项目，包括CHIP、Luciferase检测、RIP、q-pcr、RNA pull-down、WB、慢病毒稳转株的建立（过表达/敲低），其中Luciferase检测、CHIP、pull-down、RIP为本公司主营项目。

一、 CHIP实验：主要研究蛋白与基因启动子之间的关系

本实验用目的蛋白抗体钓取与之结合的DNA，然后进行高通量测序，筛选出了与Lnc-DC高结合的蛋白PU.1。

二、 Luciferase检测：检测转录因子和其靶启动子中的特异序列结合的重要手段

  本实验将Lnc-DC启动子片段全长和突变序列连接到报告质粒荧光素酶基因启动子区，与PVT1表达载体共转染后检测荧光素酶活性，找出了Lnc-DC启动子上PVT1的结合位点。

三、 RNA pull-down实验：检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间相互作用的主要实验手段之一。

用Lnc-DC探针捕获互作的蛋白，后续进行银染、Western检测，验证Lnc-DC与STAT3结合。我公司在实验体系中同时提供lncRNA正义链与反义链的pull down。

四、 RIP实验：主要研究蛋白与RNA的相互作用

本实验分别用STAT3和STAT1蛋白抗体，在全蛋白提取液中获取蛋白-RNA，洗脱RNA，反转录，qPCR检测，表明STAT3与Lnc-DC高度结合。我公司在实验体系中设置阳性及阴性对照，进一步排除系统误差。

    五、FISH技术：免疫荧光原位杂交，对细胞内核酸和蛋白的定位。

用带荧光标记的RNA探针和蛋白抗体检测同一细胞中的RNA和蛋白，实现RNA与蛋白的共定位，本实验表明了Lnc-DC与蛋白在细胞核和细胞质中有互作。我公司在实验体系中设置阴性和阳性对照。

参考文献: Pin Wang, Yiquan Xue, Yanmei Han,et al. The STAT3-Binding Long Noncoding RNA lnc-DC Controls Human Dendritic Cell Differentiation［J］.Science,2014,10.1126